吳巧群，許厚強，崔小芝，楊麗紅，諶穎蓮

（1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；3.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025；4.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽 550025；5.貴州大學醫(yī)學院，貴州貴陽 550025）

MicroRNAs（miRNA）是由20～25 個核苷酸組成的非編碼RNA 小分子，其通過與靶mRNA 的3'-UTR端區(qū)域結合來抑制目的基因的翻譯或降解目的基因[1]，從而參與動物、植物、病毒、細菌[2-5]中多種生理或病理過程的調控。隨著對miRNA 的深入了解，牛[6]、羊[7]、豬[8]等家畜也不斷被作為研究對象，目前miRNA 在豬方面的研究主要集中在對脂肪、肌肉、生殖系統(tǒng)以及疾病的發(fā)生發(fā)展方面，但當中的具體調控機制還有待研究。對miRNA 的研究方法主要通過高通量測序、微陣列芯片、RT-qPCR 等技術來提高檢測的特異性與靈敏度[9]，雖然軟件的預測準確性不斷提高，可仍需要實驗手段才能得以驗證。從江香豬屬于地方型豬種，具有肉質細嫩、抗病性強、基因純合度高等特點，但該豬種體型矮小，生長緩慢[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PRKAA1基因在從江香豬各組織中均有表達且在肺組織的表達量最高[11]。吳小敏通過在線軟件篩選出PRKAA1基因相關的2 條LncRNAs，分別是ALNCI 和ALNC2，并通過構建相應真核表達載體干擾、熒光定量PCR 以及檢測蛋白等證實這2 個LncRNAs 可促進脂肪形成和脂肪前體細胞分化[12]。因此，本實驗以PRKAA1基因為研究背景，篩選相應miRNAs，研究篩選出的miRNA 對從江香豬生物機制的調控。為了研究差異表達miRNAs 的生物學功能，本實驗篩選出多個miRNAs 后，選取表達量相對較高的miRNA-143-3P 為研究對象，了解該miRNA 在從江香豬組織中的表達規(guī)律，為后期研究miR-143-3P對從江香豬生長和生物功能的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 在貴州大學種豬場采集2 月齡從江香豬的胃、大腸、舌、腦、腎、肝、肺、脾、小腸各組織樣30 g，分裝放入液氮中，隨后將其轉移至-80℃冰箱中保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 普通PCR 儀（Bio-Rad）、CFX-96熒光定量PCR 儀（Bio-Rad）；DH5α感受態(tài)細胞由貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室保存。pMD-19-T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司，逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；2×EsTaq Master Mix 購自康為世紀生物科技有限公司；DM 2000 Marker 購自擎科生物技術有限公司；Trizol 試劑購自英駿生物技術有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇、75%的酒精購自宏達爾生物科技有限公司；超微量紫外分光光度計購自美國Thermo Scientific 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 miR-143-3P 的預測 根據(jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中豬的PRKAA1基因（登錄號：XM-0210 76522）3'-UTR 端序列，利用R 軟件（http://cran.r-project.org）編寫SWChen 2.3 程序以Simth-Waterman 算法預測出候選的miRNAs，將預測的結果與高通量測序的部分結果運用在線軟件Venny2.1 做韋恩圖取三者交集，選出表達量相對較高的miRNAs。

1.2.2 引物設計 從NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找豬的miR-143-3P 序列（登錄號：NR_038529.1），采用莖環(huán)法設計引物選取特異性莖環(huán)用于逆轉錄，以GAPDH作為內參基因，引物合成均由生工生物工程股份有限公司完成。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 從江香豬miR-143-3P 序列克隆 根據(jù)Trizol 試劑盒說明書提取從江香豬胃、大腸、舌、腦、肺、腎、肝、脾、小腸組織的總RNA，將各樣本RNA 進行濃度測定。根據(jù)逆轉錄試劑盒說明，反應體系為20 μL。第一步，在無酶的PCR 管中加入1 μL 的DNA 酶，10×RT Buffer 1 μL，各RNA 樣與水共加8 μL，共10 μL，放入PCR儀中37℃ 2 min，55℃ 5 min。第二步，加入莖環(huán)引物1 μL，內參下游1 μL，dNTP Μixture 1 μL，再加水2 μL，65℃ 5 min。第三步，加入5×RT Buffer 4 μL，逆轉錄酶加1 μL，25℃ 10 min，50℃ 30 min，85℃ 5 min。以脾臟的cDNA 為模板進行PCR 擴增。反應體系為20 μL：cDNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL（10 mmoL），2×EsTaq Μaster Μix 10 μL，加水7 μL。PCR 反應條件：預變性95℃ 5 min，變性95℃ 30 s，退火59℃ 30 s，25 個循環(huán)，延伸72℃ 5 min。產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，與maker 比對，將與目的條帶相近的部分進行膠回收，再與pMD-19-T 載體連接，并轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，在氨芐板中挑選出陽性菌落，送至生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.4 miR-143-3p 序列保守性分析 利用MegAlign 軟件將miR-143-3P 的成熟序列與人（Homo sapiens，hsa）、豬（Sus scrofa，sus）、山羊（Capra hircus，chi）、小鼠（Mus muscμLus，mmu）、鯉魚（Cyprinus carpio，ccr）、馬（Equus caballus，eca）、雞(Gallus gallus，gga)、牛（Bos taurus，bta）的前體序列進行同源性分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR 將逆轉錄各組織的cDNAs 進行Real-time qPCR 反應，反應體系為10 μL：2×ΜLtra SYBR Mixture（High ROX）5 μL，上下游引物各1.5 μL（10 mmoL）、cDNA 1 μL、水1 μL；反應程序：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，59℃退火45 s，40 個循環(huán)；每個樣品都有3 個重復，檢測結果運用2-ΔΔCt公式計算，用SPSS19.0 軟件分析，當P<0.05 時表示差異顯著，P<0.01 時表示差異極顯著。

2 結果

2.1 靶基因的預測 利用R 軟件編寫SWChen 2.3 程序以PRKAA1 基因3'-UTR 端篩選出的miRNAs 選取803個，再以miRNA 的種子區(qū)篩選出825 個，選取高通量測序部分結果中的40 個，利用Draw Venn Diagram 在線（http://bioinformatics.psb.ugent.be）軟件選取三者（圖1）共有的8 個miRNAs，其中包含有miR-143-3P。

圖1 以PRKAA1 的3'-UTR 預測的miRNAs 交集結果

2.2 從江香豬miR-143-3P 的克隆及保守性分析 以從江香豬脾臟的cDNA 為模板進行PCR 擴增，成功克隆出從江香豬miR-143-3P 序列，擴增總長度為88 bp（圖2），測序結果比對也完全一致（圖3），其中miR-143-3P 的序列長度為21 bp。

圖2 從江香豬miR-143-3P 克隆菌液PCR 結果

MegAlign 軟件對從江香豬miR-143-3P 成熟序列與不同物種間的同源性分析結果如圖4 所示，從江香豬中miR-143-3P 的成熟序列與山羊、牛、人、鯉魚、豬、馬、雞、小鼠前體miRNA-143 的序列相似性都是100%。

2.3 miR-143-3P 在從江香豬各組織中的表達差異 由圖5可知，熔解曲線峰值單一，表明實驗數(shù)據(jù)可用。檢測結果（圖6）顯示，miR-143-3P 在從江香豬各組織中均有表達，其中在肝中表達量最高，在舌組織中表達量最低；在肝、胃、脾、肺、小腸中表達量均極顯著高于大腸、舌、腦、腎（P<0.01）；在肺和小腸中表達差異不顯著（P>0.05）；在舌、腦、腎之間的表達量差異不顯著（P>0.05）。

3 討 論

圖3 從江香豬miR-143-3P 測序結果圖

圖4 miR-143-3P 成熟序列與不同物種miRNA-143 的前體序列比對

近年來，越來越多的研究表明miRNA 參與動物的基本生理功能，例如在冷應激下，大鼠肝臟中的miRNA-383、miRNA-92a 表達有極顯著升高[13]，在奶牛熱應激中miRNA-19a 與miRNA-19b 都參與了調控[14]；miRNA 還參與了豬生殖器官的發(fā)育，如Wright 等[15]證實了miRNA-21 表達會影響卵母細胞的成熟率；miRNA 還參與了絨山羊絨毛的生長，在絨毛生長的不同時期，miRNA-1298-5P 具有差異性表達，還可通過負調控TGF-βRI基因對絨山羊絨毛的生長起調節(jié)作用，促進絨毛生長[16]。這些都體現(xiàn)出miRNA 在動物機體中參與的調控較多，起重要作用。從江香豬的肌內脂肪含量高于大白豬[17]，肌內脂肪含量又是影響肉質品質的重要因素，有研究表明miRNA 能夠調控豬脂肪代謝[18]，由此推測miRNA 可能參與從江香豬生長發(fā)育的調控。

研究動物的miRNA 靶基因預測軟件較多，有TargeScan、RNAhybrid、MiRBase、miRTarBase、miRWalk 等，但這些軟件也可通過某個具體基因來預測相應的miRNAs，預測機制各有不同，有通過基因的3'-UTR 與軟件數(shù)據(jù)庫中miRNAs 靶向結合來預測[19]，也有通過基因與miRNA 之間形成二聚體來預測基因的miRNAs[20]。這些軟件預測的結果都存在著假陽性，應結合多個軟件預測，取交集選用共有的miRNAs 或靶基因來減少假陽性。

miR-143 為廣泛性表達的基因，該miRNA 與肉品質以及代謝多方面的調控作用存在密切聯(lián)系，所以一直都是研究熱點。為了解miR-143-3P 在從江香豬的表達規(guī)律，本實驗以從江香豬中脾臟的cDNA 為模板成功克隆出miRNA-143-3P 的成熟序列，比對分析發(fā)現(xiàn)其與人、豬、鼠、牛、馬、鯉魚、雞、山羊的前體序列完全一致，這說明miR-143-3p 序列在各物種間為高度保守，與高玲玲[21]研究has-miR-143、趙冉[22]研究廣西巴馬小型豬miR-143-5p 的保守性一致，這提示了該基因在生物學功能的相似性和重要性。本實驗利用實時熒光定量PCR 檢測時發(fā)現(xiàn)，該基因在從江香豬的9 個組織中均有表達，且表達水平存在差異，其中在肝、脾、胃中的表達高于其他組織。miR-143-3P 在從江香豬各組織的表達水平與李東偉[23]、張曉東[24]等人分別在牛、白山羊中的研究結果不同，以往研究顯示在肝臟中的表達量較低，在脾臟與胃的表達量豐富；與云青[25]在長白豬的研究存在差異，該研究中的miRNA-143-3P 在心臟表達水平高，其次是肝臟，而在脾臟中的表達量較低。進一步證實了miRNA 的表達水平在不同物種、不同品種動物中的同一組織存在較大差異[26]，導致這樣結果的原因可能與各器官在不同品種中的功能性強弱有關。這也提示了miRNA-143-3P 可能在從江香豬肝臟中的發(fā)育及功能發(fā)揮中起重要作用。

4 結 論

本實驗通過PRKAA1基因3'-UTR 成功篩選出相關miR-143-3P，以從江香豬的脾cDNA 為模板成功克隆出miR-143-3P 序列，實時熒光定量PCR 檢測出該miRNA 在各組織中均有表達，且在肝中的表達量最高，其次是胃與脾；對miR-143-3P 進行生物信息學分析，結果顯示miRNA 具有較高的保守性。