倪一凡，蔡劍鋒，陳強(qiáng)強(qiáng)，胡金平，沈家聰，張金枝*

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.杭州大觀山種豬育種有限公司，浙江余杭 311100）

母豬熱應(yīng)激（Heat Stress,HS）是母豬對(duì)高溫環(huán)境產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)的總和[1]。高溫環(huán)境嚴(yán)重影響母豬的攝食、繁殖、泌乳和新陳代謝[2-3]。其中，泌乳是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、多因素調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程。高熱條件下，母豬皮膚毛細(xì)血管血流量增大、散熱增加從而影響母豬泌乳效率[4]。此外，HS 會(huì)導(dǎo)致母豬繁殖力下降、發(fā)病率增加，嚴(yán)重情況下會(huì)直接導(dǎo)致母豬死亡。我國(guó)南方夏季高溫時(shí)間長(zhǎng)，嚴(yán)重影響母豬生產(chǎn)性能的發(fā)揮，研究HS 下母豬的泌乳機(jī)理具有重要意義。

環(huán)狀RNA（circRNA）作為一種非編碼RNA，廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌的真核生物中，具有調(diào)節(jié)真核生物基因表達(dá)的作用[5]。circRNA 不具有5' 和3'末端，首尾共價(jià)鍵相連形成閉合環(huán)狀RNA 分子，不能被核糖核酸酶降解[6-7]，因此它比線性RNA 更穩(wěn)定。近年來(lái)，豬相關(guān)的circRNA 研究越來(lái)越多。有研究發(fā)現(xiàn)circRNA 能夠調(diào)節(jié)豬的成脂分化和脂質(zhì)代謝[7]，另外，豬肝臟中的circRNA 在肝臟代謝調(diào)控中起重要作用[8]。Zhang 等[9]研究發(fā)現(xiàn)一些circRNA 可以作為miRNA 的“分子海綿”來(lái)調(diào)節(jié)垂體特異性基因和熱休克蛋白家族成員的表達(dá)，說(shuō)明母豬垂體中的circRNA 在HS 情況下發(fā)揮作用。然而，目前關(guān)于泌乳母豬乳腺的circRNA 研究還很少。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)HS 顯著降低母豬的泌乳量，并損傷泌乳母豬的生理功能[10]。此次研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)HS 下泌乳母豬乳腺中的circRNA 進(jìn)行識(shí)別和鑒定、功能分析、構(gòu)建circRNA與miRNA 互作網(wǎng)絡(luò)，旨在篩選與泌乳性能相關(guān)的候選circRNA。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)選取長(zhǎng)白泌乳母豬作為研究對(duì)象，檢測(cè)在不同環(huán)境溫度下泌乳母豬的泌乳指標(biāo)，取HS 和正常環(huán)境溫度下泌乳母豬的乳腺組織，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以探討HS 情況下母豬乳腺組織中circRNA 的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)在浙江省杭州市大觀山種豬育種有限公司進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品收集和RNA 分離 本實(shí)驗(yàn)分2 個(gè)階段，首先在8 月1 日—9 月3 日進(jìn)行HS 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，在11 月22 日—12 月24 日進(jìn)行正常養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)由實(shí)驗(yàn)?zāi)肛i分娩日期決定）。2 個(gè)階段各選取20 頭胎次體重和分娩日期相近的妊娠長(zhǎng)白母豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，2組實(shí)驗(yàn)中的每頭妊娠母豬都在產(chǎn)前7 d 提前進(jìn)入產(chǎn)房進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以仔豬出生到28 日齡斷奶作為一個(gè)正試期，測(cè)定2 種狀態(tài)下泌乳母豬的日均泌乳量、血液生化及免疫指標(biāo)[10]。除了環(huán)境溫度不同外，HS 組與正常（TC）組中其他飼養(yǎng)管理?xiàng)l件完全一致。在哺乳的第28 天（仔豬斷奶日）從2 組中均隨機(jī)挑選3 頭泌乳母豬，收集乳腺組織（HS：H-RX1，H-RX2 和H-RX3；TC：L-RX1，L-RX2 和L-RX3），并保存在-80℃直至提取RNA。然后按照說(shuō)明使用TRIzol 試劑從乳腺組織中分離出總RNA。使用Thermo Scientific Nanodrop NC2000（Thermo Scientific，NY，USA）檢測(cè)樣品RNA 的濃度和純度，使用Agilent 2100 生物分析儀（美國(guó)加利福尼亞州安捷倫科技公司）的RNA 6000 Nano Kit 5067-1511 來(lái)確定RNA 的完整性。

1.2.2 RNA 文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序 首先，使用美國(guó)Illumina公司Ribo-Zero rRNA Removal Kit 去除乳腺組織總RNA樣品中的rRNA、線性RNA，并將RNA 片段化為200～300 bp。然后，以circRNA 片段為模板，使用隨機(jī)的六核苷酸引物合成cDNA 第1 鏈；再以第1 鏈cDNA 為模板，合成cDNA 第2 鏈。當(dāng)合成第2 鏈cDNA 時(shí)，使用dUTP 代替dTTP，并且將不同的銜接子連接到第2 條鏈的5' 末端和3' 末端。隨后，在DNA 片段的3' 末端進(jìn)行腺苷酸化后，將進(jìn)一步的雜交與Sequencing Adapter 連接。最后，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增以富集cDNA 文庫(kù)，在Illumina Hiseq 2500 平臺(tái)上運(yùn)行Pair End 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序程序。

1.2.3 circRNA 的鑒定和差異表達(dá)分析 使用Cutadapt（v1.15）從原始數(shù)據(jù)中過(guò)濾包含少量帶有測(cè)序接頭、ploy-N 或測(cè)序質(zhì)量較低的reads，最終可以獲得clean reads。使用Tophat 2.0.14 將過(guò)濾后的測(cè)序序列與豬的參考基因組（asia.ensembl.org/index.html）進(jìn)行比對(duì)；使用Bowtie2 將未映射讀段的20 bp 末端進(jìn)行融合基因比對(duì)，使用find_circ 軟件驗(yàn)證circRNA。統(tǒng)計(jì)分析鑒定的circRNA 的染色體分布和類型。DE Seq（1.30.0）軟件用于分析差異表達(dá)的circRNA，比較TC 組和HS 組，以|log2(ford change)| ≥1 為閾值，P<0.05 的circRNA被認(rèn)為顯著差異；并使用R 語(yǔ)言P heatmap（1.0.8）軟件包對(duì)circRNA 進(jìn)行雙向聚類分析（http://CRAN.R-project.org/package=pheatmap）。

1.2.4 功能富集分析和靶向預(yù)測(cè) 使用DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp）對(duì)差異表達(dá)的circRNA 的親本基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析，P<0.05 被認(rèn)為顯著富集。由于circRNA 可以充當(dāng)miRNA 的“分子海綿”來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[11]，使用miRanda 軟件（http://www.mirbase.org/index.shtml）進(jìn)行miRNA 預(yù)測(cè)，以進(jìn)一步研究circRNA 的功能，并使用Cytoscape v3.4 軟件繪制circRNA-miRNA 互作網(wǎng)絡(luò)圖[12]。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證 從測(cè)序所得的差異表達(dá)的circRNA 中，隨機(jī)選取5 個(gè)進(jìn)行驗(yàn)證，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa,China）來(lái)合成cDNA。然后以cDNA為模板，用SYBR Premix Ex TaqTM（Takara，Hangzhou，China）的熒光定 量PCR 試劑在Thermo Scientific StepOnePlus 進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)中以甘油醛 3 磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 circRNA 的鑒定 使用RNA-seq 對(duì)乳腺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析以鑒定在HS 中對(duì)母豬泌乳相關(guān)的circRNA，測(cè)序結(jié)果列于表2。除去接頭序列、ploy-N、低質(zhì)量的reads 后，獲得了80 407 848 至85 984 968 的clean reads。使用TopHat 2.0.14 將這些reads 的83.78%定位到參考豬基因組的未融合基因，并且將83.33%以上的位點(diǎn)獨(dú)特定位。從6 個(gè)樣品中共鑒定出20 311 個(gè)候選circRNA，其中大多數(shù)分布在1 號(hào)染色體上，其次是13號(hào)和6 號(hào)染色體（圖1-A）。此外，根據(jù)circRNA 結(jié)果和find_circ 識(shí)別出的基因組注釋信息，這些circRNA 被分為6 種類型，其中annot_exons 類型最多（圖1-B）。

2.2 circRNA 的差異表達(dá)分析 根據(jù)|log2(ford change)|>1和P<0.05，計(jì) 算HS 組 和TC 組之間差 異表達(dá)的circRNA，以更好地研究HS 環(huán)境中母豬泌乳的調(diào)控機(jī)制。與TC 組相比，HS 組共獲得了187 個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中106 個(gè)上調(diào)，而81 個(gè)下調(diào)（圖2-A）。如圖2-B 所示，H-RX 和L-RX 在基因表達(dá)水平上的模式明顯不同，這表明RNA 序列的結(jié)果是有效的并且可以進(jìn)一步分析。

2.3 宿主基因的功能富集分析 GO 富集分析表明，差異表達(dá)的circRNA 的大多數(shù)親本基因在Rab GTPase 結(jié)合、生物學(xué)負(fù)調(diào)控的過(guò)程和Ras GTPase 結(jié)合方面均顯著富集（圖3-A）。此外，KEGG 途徑分析表明，差異表達(dá)的circRNA 的大多數(shù)親本基因均與cAMP 信號(hào)傳導(dǎo)通路、HIF-1 信號(hào)傳導(dǎo)通路、FoxO 信號(hào)傳導(dǎo)通路和Ras 信號(hào)傳導(dǎo)通路顯著相關(guān)（圖3-B）。

2.4 circRNA-miRNA 互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè) circRNA 被證實(shí)可以作為miRNA 的“分子海綿”，與miRNA 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。circRNA-miRNA 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，同一個(gè)circRNA 可以靶向多個(gè)miRNA，同一個(gè)miRNA可以被多個(gè)circRNAs 靶向。在這里，187 個(gè)差異表達(dá)的circRNAs 可以跟466 個(gè)miRNA 互作。為了更直觀地展現(xiàn)兩者之間的相互關(guān)系，選取6 個(gè)circRNAs（ssccirc_134615、ssccirc_096340、ssccirc_104399、ssccirc_098353、ssccirc_078984 和ssccirc_135768），利用Cytoscape v3.4 制作了circRNA-miRNA 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（max-energy<-25）（圖4）。

2.5 熒光定量PCR驗(yàn)證 隨機(jī)選取5個(gè)circRNAs（ssccirc_092780、ssccirc_002690、ssccirc_095321、ssccirc_051419、ssccirc_078984）進(jìn)行qRT-PCR 以驗(yàn)證RNA 測(cè)序結(jié)果的可靠性，結(jié)果如圖5 所示，qRT-PCR 結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可靠。

3 討 論

泌乳是哺乳動(dòng)物普遍存在的特征，也是哺乳動(dòng)物繁殖過(guò)程中重要的環(huán)節(jié)[13]。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中HS 嚴(yán)重影響了母畜的泌乳量和乳成分，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失[14]。有研究在產(chǎn)后第1 天（D1）和第7 天（D7）從泌乳的大鼠乳腺中分別鑒定到6 824 個(gè)和4 523 個(gè)circRNAs[15]；在產(chǎn)后第90 天和250 天的牛乳腺組織中分別鑒定出4 804 個(gè)和4 048 個(gè)circRNAs[16]。此外，在人類乳腺中共檢測(cè)到9 665 個(gè)circRNAs[17]。本次研究中，在母豬乳腺中共鑒定出20 311 個(gè)circRNAs，其中相比于常溫，HS 組有187 個(gè)circRNAs 差異表達(dá)，包括106個(gè)上調(diào)和81 個(gè)下調(diào)。上述不同結(jié)果可能是由于哺乳動(dòng)物的乳腺組織發(fā)育與激素水平、品種、遺傳性能、營(yíng)養(yǎng)狀況和飼養(yǎng)管理等有關(guān)。

表2 測(cè)序結(jié)果

圖1 染色體分布圖（A）和類型分布圖（B）

圖2 火山圖（A）和聚類分析圖（B）

圖3 親本基因的GO 富集分析圖（A）和KEGG 通路分析圖（B）

圖4 circRNA-miRNA 互作分析圖

圖5 熒光定量PCR 驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果

一些研究表明，circRNA 通過(guò)特定的RNA-RNA相互作用調(diào)節(jié)其親本基因在cis 中的聚合酶II 轉(zhuǎn)錄[18]。因此，本文通過(guò)探索與circRNA 相關(guān)的親本基因的潛在功能來(lái)研究circRNA 的功能。GO 功能富集分析表明，差異表達(dá)的circRNAs 的大多數(shù)親本基因與Rab GTPase結(jié)合、生物學(xué)過(guò)程的負(fù)調(diào)控、Ras GTPase 結(jié)合顯著相關(guān)。Rab 蛋白屬于小鳥(niǎo)苷三磷酸酶（GTPases）超家族，它作為分子開(kāi)關(guān)在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[19]。因此，本文推測(cè)高溫可能會(huì)影響細(xì)胞的正常功能。通過(guò)KEGG 信號(hào)通路分析，親本基因富集最多的通路為cAMP 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路和Ras 信號(hào)通路。本研究中，差異表達(dá)的sscirc_044883和ssccirc_008385 的親本基因MAPK10 富集在cAMP信號(hào)通路。MAPK 是多種生物化學(xué)信號(hào)通路的整合點(diǎn)，參與細(xì)胞增殖、分化等多種過(guò)程[20]，而cAMP 信號(hào)通路的激活也可能與熱應(yīng)激下母豬采食量減少有關(guān)[21]。此外，低氧誘導(dǎo)因子HIF 可以作為細(xì)胞對(duì)低氧應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。據(jù)報(bào)道，HIF-1 信號(hào)通路在所有生物體中可以激活同源或相似的基因表達(dá)，導(dǎo)致類似的生物化學(xué)反應(yīng)，其中包括氧傳感器動(dòng)員、氧運(yùn)輸和血管細(xì)胞的生成[22]。泌乳期間，乳腺中氧氣的供應(yīng)對(duì)細(xì)胞存活和維持泌乳至關(guān)重要，然而在泌乳期乳腺通常會(huì)發(fā)生缺氧[23]。本研究中親本基因ENSSSCG00000005096（HIF1A）富集在HIF-1 信號(hào)通路，HIF1A（低氧誘導(dǎo)因子1α）是低氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，在乳腺上皮細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮中起關(guān)鍵作用，是維持正常泌乳和產(chǎn)奶所必需的[24-25]。HS 下的泌乳母豬會(huì)缺氧并減少采食量，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)奶量減少，這可能會(huì)阻礙泌乳期間仔豬正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

豐富的內(nèi)源性circRNA 可以作為有效的miRNA“分子海綿”，從而增加基因表達(dá)調(diào)控功能的生長(zhǎng)庫(kù)[26]。目前已經(jīng)報(bào)道了許多miRNA 參與HS 的反應(yīng)，包括miR-34a[27-28]、miR-21-5p[29]和miR-181b[30]。其中，miR-34a 是p53 的效應(yīng)子，與DNA 損傷和修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡有關(guān)[27]。Yu 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，熱處理后大鼠小腸中rno-miR-34a 明顯上調(diào)，推測(cè)miR-34 可能會(huì)參與HS 誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡過(guò)程中。Li 等[29]研究鑒定出差異表達(dá)的bta-miR-21-5p 可能在HS 期間起主導(dǎo)作用，它們通過(guò)上調(diào)或下調(diào)差異表達(dá)的miRNA 減少HS 對(duì)荷斯坦奶牛的傷害。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)HS 下的荷斯坦牛中，miR-181b 與免疫反應(yīng)有關(guān)[30]。因此，本研究中，為了進(jìn)一步揭示circRNA 的重要功能，使用miRanda 軟件來(lái)預(yù)測(cè)潛在的miRNA 結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)所有極顯著（P<0.01）circRNA 的表達(dá)來(lái)篩選出候選的miRNA，共鑒定出307 個(gè)差異表達(dá)circRNA 可以作為457 個(gè)miRNA 的海綿，從中發(fā)現(xiàn)miR-34a、miR-21-5p 和miR-181b 與sscirc_078984、sscirc_098353和sscirc_135768 靶向結(jié)合。這些預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)表明circRNA 在HS 下通過(guò)miRNA 相互作用調(diào)節(jié)泌乳過(guò)程。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA-seq 技術(shù)對(duì)HS 和常溫條件下泌乳母豬的乳腺進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)共有187 個(gè)差異表達(dá)的circRNAs，包括106 個(gè)上調(diào)和81 個(gè)下調(diào)；對(duì)差異表達(dá)的circRNA 的親本基因進(jìn)行功能分析和互作分析，初步發(fā)現(xiàn)，sscirc_078984、sscirc_098353和sscirc_135768 可能參與HS 下母豬泌乳的調(diào)控，為后續(xù)circRNAs 對(duì)母豬泌乳的研究提供了理論基礎(chǔ)。