安清明，王 星，孟金柱，吳震洋，趙園園，羅玉柱

（1.銅仁學(xué)院貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州銅仁 554300；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070）

脂肪組織能分泌具有生物活性的脂肪因子，從而參與機(jī)體能量代謝調(diào)節(jié)，因此是調(diào)節(jié)能量代謝途徑的主要研究對(duì)象。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Fibroblast Growth Factors，F(xiàn)GFs）是一類結(jié)構(gòu)相似、具有多種生物功能的信號(hào)蛋白，能夠參與能量代謝、細(xì)胞增殖分化等[1-2]，對(duì)生物體的個(gè)體發(fā)育和新陳代謝具有重要作用[3]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（Fibroblast Growth Factor 21，F(xiàn)GF21）是該家族的一個(gè)重要的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)蛋白因子，其最早于2000 年被克隆出來(lái)，編碼基因定位于人類19號(hào)染色體，全長(zhǎng)共1 459 bp，包含3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子，編碼209 個(gè)氨基酸，成熟氨基酸181 個(gè)，N 末端信號(hào)肽殘基氨基酸28 個(gè)。隨后于2005 年發(fā)現(xiàn)FGF21蛋白因子是一個(gè)新的具有多種生物學(xué)功能的代謝調(diào)節(jié)因子，在新陳代謝中能夠調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)脂肪組織中糖類的攝取[4]、能量的損耗[5]、調(diào)節(jié)肥胖癥患者的葡萄糖和磷脂水平[6]，同時(shí)還能促進(jìn)脂肪酸氧化和酮體生成[7]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21 蛋白因子不僅在葡萄糖和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，在維持能量平衡中也具有一定功能[5,8]。研究表明，F(xiàn)GF21 蛋白因子可以分泌信號(hào)因子直接作用于白色脂肪組織，促進(jìn)能量代謝，也能促進(jìn)褐色脂肪組織細(xì)胞（BAT）中產(chǎn)熱基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)節(jié)能量的目的[9-10]。亦有研究表明，F(xiàn)GF21 蛋白因子在不同組織中的表達(dá)模式與不同的生理功能相關(guān)，如FGF21 蛋白因子在肝臟中的表達(dá)水平與小鼠禁食和恢復(fù)進(jìn)食的狀態(tài)存在關(guān)聯(lián)性[11-13]，在脂肪組織的表達(dá)和分泌可以通過(guò)cAMP 通道調(diào)節(jié)FGF21基因轉(zhuǎn)錄，影響去甲狀腺腎上腺素的分泌水平，從而調(diào)節(jié)進(jìn)食狀態(tài)中脂肪組織的功能[10]。綜上，F(xiàn)GF21 蛋白因子在機(jī)體組織能量代謝中具有重要作用，表明其可以作為一個(gè)綿羊育種的候選基因。

已有相關(guān)報(bào)道，F(xiàn)GF21基因3'UTR 區(qū)多態(tài)性與人類肥胖相關(guān)[14]，牛內(nèi)含子區(qū)SNPs 位點(diǎn)g.297C/G 和g.940C/T 與18 月齡南陽(yáng)牛體重相關(guān)[15]。但綿羊FGF21基因多態(tài)性變異及與綿羊生產(chǎn)性狀的影響在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。本研究以5 個(gè)不同綿羊品種為研究對(duì)象進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，并對(duì)相關(guān)核苷酸變異與羅姆尼羊生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，探究FGF21基因核苷酸變異對(duì)綿羊生產(chǎn)性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及表型數(shù)據(jù)收集 從新西蘭南島和中國(guó)西藏采集5 個(gè)品種（特克賽爾羊、美利奴羊、羅姆尼羊、陶賽特羊和藏綿羊）123 只綿羊樣本用于多態(tài)性檢測(cè)。從新西蘭南島采集優(yōu)質(zhì)種公羊子代756 只羅姆尼羔羊樣本用于關(guān)聯(lián)性分析。羔羊出生時(shí)戴耳標(biāo)、記錄性別、日期、初生重、耳號(hào)和出生等級(jí)（單羔、雙羔和多羔）。21 日齡斷尾并測(cè)體重，同時(shí)用FTA 卡（Whatman，Middlesex，UK）收集羔羊血樣。3 月齡斷奶，測(cè)定斷奶重，計(jì)算羔羊斷奶前生長(zhǎng)速度。后期觀測(cè)因不可抗拒因素（死亡、耳號(hào)脫落等）影響，導(dǎo)致最終關(guān)聯(lián)分析的樣本數(shù)量與最初血液收集數(shù)量有一定偏差。

屠宰公羔的胴體重（V-HW）及胴體脂肪含量值（GR）在屠宰時(shí)直接測(cè)定，其他胴體性狀通過(guò)澳大利亞研發(fā)的視頻圖像分析系統(tǒng)（VIASCAN?Sastek）直接測(cè)算肩部瘦肉量、后腿瘦肉量、腰部瘦肉量、總瘦肉量（肩部、后腿、腰部瘦肉量之和）。

1.2 基因組DNA 提取 所有羊只血液基因組DNA 采用“兩步法”提取[16]。具體步驟如下：用打孔器在FTA卡上取孔徑1.2 mm 圓片1 個(gè)，置于PCR 管中，加入20 mmol/L NaOH 溶液200 μL，60°C 金屬浴加熱30 min左右（以FTA 卡圓片變白為準(zhǔn)），吸出管內(nèi)液體，再加入1×TE 溶液200 μL，洗滌5 min，吸出管內(nèi)液體，自然晾干后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 公布的綿羊FGF21基因序列（登錄號(hào)：101108510），應(yīng)用Primer 5.0軟件在線設(shè)計(jì)引物P1 和引物P2（表1），用于擴(kuò)增FGF21基因Exon-2 和Intron-2 區(qū)部分序列。25 μL PCR反應(yīng)體系：FTA 卡圓片1 個(gè)（1.2 mm，含DNA），5×Q Buffer 溶液2 μL，10×PCR Buffer 溶液2 μL，dNTPs 1.2 μL（150 μmol/L），MgCl2溶液1.2 μL（3 μmol/L），上下游混合引物1 μL（0.25 μmol/L），Taq 聚合酶0.1 μL（5U/L），ddH2O 補(bǔ)至25 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95°C 預(yù)變性3 min，95°C 變性30 s，退火30 s（P1 為62°C，P2 為58°C），72°C 延伸30 s，34 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸5 min，10°C 保存。

1.4 PCR 產(chǎn)物SSCP 檢測(cè) 取瓊脂糖檢測(cè)過(guò)的PCR 產(chǎn)物2 μL 于滅菌PCR 管中，加入8 μL 變性上樣緩沖液（98%去離子甲酰胺、0.025%二甲苯氰、0.025%溴酚藍(lán)、10 mmol/L EDTA），金屬浴105°C 熱變性5 min 后立即置于冰水混合物中冷卻5 min，然后上樣于不同濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠中（Acr:Bis=37.5:1），P1（Exon-2）：凝膠濃度14%，在30°C、200V 電壓條件下電泳19 h；P2（Intron-2）：凝膠濃度10%，在30.5°C、200V 電壓條件下電泳19 h，置于0.5×TBE 緩沖液的垂直電泳槽中電泳，電泳結(jié)束后銀染顯色，判斷SSCP 帶型。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用MegAlign 軟件進(jìn)行序列比對(duì)；利用Popgen 32.0 軟件計(jì)算等位基因頻率、Hardy-Weinberg 平衡χ2檢驗(yàn)；利用PIC 軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）；利用SHEsis 軟件分析區(qū)域間等位基因的連鎖平衡性；應(yīng)用Mintab 16.0（Minitab Inc.，Pennsylavania）軟件中一般線性模型評(píng)估等位基因?qū)d羊生長(zhǎng)速度、胴體性狀的影響。在分析模型中，等位基因、父本、初生重/出生等級(jí)為固定因素，按最小二乘法模型分析：

其中，G 為表型特征，μ 為群體效應(yīng)，Ai為父本因素，Bk為初生重/ 出生等級(jí)（取決于哪個(gè)對(duì)結(jié)果更具影響力），Cm為等位基因，Dn為不同因素互作效應(yīng)，eijkmn為隨機(jī)誤差。

在等位基因分析模型中，僅對(duì)頻率大于5%的等位基因分析；在基因型分析模型中，僅對(duì)頻率大于10%的基因型分析。結(jié)果均采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P>0.05 為無(wú)影響，P<0.05 為影響顯著。

表1 綿羊FGF21 基因的擴(kuò)增引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊FGF21基因Exon-2 區(qū)和Intron-2 區(qū)多態(tài)性分析P1和P2 引物擴(kuò)增綿羊FGF21基因Exon-2 和Intron-2 部分區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖和測(cè)序檢測(cè)，結(jié)果與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度一致（圖1）。由表2、3 可知，在172 只用于多態(tài)性檢測(cè)的綿羊樣本中，Exon-2 區(qū)檢測(cè)到M 和N 2 種等位基因，包含7 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，其中c.304 C/T 位于編碼區(qū)，為同義突變，其余6 個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)，等位基因頻率分別為78.63%和21.37%，共構(gòu)成3 種基因型MM、MN 和NN，基因型頻率分別為62.39%、32.48%和5.13%，M 和N 2 種等位基因在5 個(gè)不同品種中均存在，M 等位基因均為優(yōu)勢(shì)等位基因。在Intron-2 區(qū)，共檢測(cè)到A、B 和C 3 種等位基因，包含3個(gè)SNPs 位點(diǎn)，等位基因頻率分別為73.71%，19.83%和6.47%，A 和B 在所有品種中均檢測(cè)到，且B 是最普遍的等位基因，C 是總樣本中基因頻率最低的等位基因，且在美利奴羊和羅姆尼羊中未檢測(cè)到C 等位基因，但在特克賽爾羊中其基因頻率卻又比較高，達(dá)28.26%。3 個(gè)不同等位基因在本研究中共檢測(cè)到5 種基因型AA、AB、BB、AC 和BC，頻率分別為15.52%、26.72%、54.31%、0.86%和2.59%，其中BB 為優(yōu)勢(shì)基因型。

圖1 綿羊FGF21 基因Exon-2 區(qū)和Intron-2 區(qū)SSCP 檢測(cè)結(jié)果

表2 綿羊FGF21 基因Exon-2 區(qū)和Intron-2 區(qū)突變位點(diǎn)

2.2FGF21基因變異與綿羊生長(zhǎng)及胴體性狀關(guān)聯(lián)分析對(duì)最終具有完整生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù)的羅姆尼羔羊進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，鑒于Exon-2 區(qū)等位基因類型少于Intron-2 區(qū)中的等位基因類型，因此只對(duì)Intron-2 區(qū)中等位基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，但I(xiàn)ntron-2 區(qū)中僅有等位基因A 和B 的基因頻率大于5%，因此本研究?jī)H對(duì)618 只檢測(cè)到Intron-2區(qū)等位基因A 和B 群體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析分析。

表3 FGF21 基因不同區(qū)域在各品種中的等位基因頻率

生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明（表4），存在等位基因A 的群體具有較高的斷尾重和斷奶重（P<0.05），存在等位基因B 的群體具有較低斷尾重、斷奶重和斷奶前生長(zhǎng)速度（P<0.01），基因型分析結(jié)果表明（表5），AA 基因型群體的斷尾重、斷奶重和斷奶前生長(zhǎng)速度高于其他基因型（P<0.01），與等位基因存在/缺失結(jié)果相符。

對(duì)屠宰的364 只公羔進(jìn)行胴體性狀關(guān)聯(lián)分析，由表6 可知，存在等位基因B 的群體具有較低的GR 值，基因型結(jié)果分析表明（表7），AA 型群體的GR 值顯著高于存在B 的基因型群體，與等位基因分析結(jié)果相符，未發(fā)現(xiàn)其他胴體性狀與等位基因和基因型存在顯著關(guān)聯(lián)性。

表4 FGF21 基因Intron-2 區(qū)等位基因與綿羊生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)性分析

3 討 論

本研究共發(fā)現(xiàn)10 個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，表明綿羊FGF21基因存在一定的核苷酸變異。目前在其他物種中也發(fā)現(xiàn)FGF21基因存在一定核苷酸變異，如人類和牛[15,17]，進(jìn)一步驗(yàn)證了FGF21基因存在一定的遺傳多樣性。在發(fā)現(xiàn)的10 個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)中只有c.304 C/T位于編碼區(qū)，但屬于同義突變；其他9 個(gè)突變位點(diǎn)均在Intron-2 區(qū)，雖然目前還不能直接證明內(nèi)含子區(qū)的核苷酸變異能夠直接影響基因的結(jié)構(gòu)與功能，但內(nèi)含子區(qū)存在一些可以影響基因轉(zhuǎn)錄效率的結(jié)合位點(diǎn)，如增強(qiáng)子、沉默子等[18-19]。有研究表明，內(nèi)含子區(qū)的突變位點(diǎn)可以與基因編碼區(qū)的具有轉(zhuǎn)錄翻譯的突變位點(diǎn)或區(qū)域連鎖影響基因的轉(zhuǎn)錄效率和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的存在于內(nèi)含子區(qū)的核苷酸變異位點(diǎn)值得進(jìn)一步研究其具體的生理功能。

表5 FGF21 基因Intron-2 區(qū)基因型對(duì)綿羊生長(zhǎng)性狀的影響

表6 FGF21 基因Intron-2 區(qū)等位基因?qū)d羊胴體性狀的影響

本研究所檢測(cè)的Intron-2 區(qū)等位基因中只有等位基因A 和B 比較普遍，而等位基因C 和D 比較稀少，這可能是綿羊在長(zhǎng)期飼養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的人工選擇，等位基因C 和D 與一些生產(chǎn)性能呈負(fù)相關(guān)而被篩選淘汰。這一結(jié)果同時(shí)表明，F(xiàn)GF21基因的核苷酸變異可能與綿羊的生產(chǎn)性狀相關(guān)。再者如在Intron-2 區(qū)中，等位基因C 在美利奴羊和羅姆尼羊中未檢測(cè)到，但在特克賽爾羊中頻率較高，這可能是不同品種的進(jìn)化差異所致，也可能是不同綿羊品種在長(zhǎng)期飼養(yǎng)過(guò)程中牧民根據(jù)某些生產(chǎn)性能人為篩選的結(jié)果，這也從側(cè)面表明FGF21基因變異可能與某些生產(chǎn)性能相關(guān)。等位基因與綿羊生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，不同等位基因與綿羊的斷尾重、斷奶重和斷奶前生長(zhǎng)速度均存在一定關(guān)聯(lián)性。在小鼠中，F(xiàn)GF21基因與小鼠機(jī)體的能量消耗具有一定關(guān)聯(lián)性，基因突變可以影響小鼠體重[5]；在牛中，Sun 等[15]研究表明，F(xiàn)GF21基因的核苷酸變異與牛18 月齡體重存在一定關(guān)聯(lián)性。因此，可以推斷本研究分析所得FGF21基因不同等位基因與綿羊生長(zhǎng)性狀存在影響具有一定的依據(jù)，可以進(jìn)一步加大樣本量研究FGF21基因變異對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響。

表7 FGF21 基因Intron-2 區(qū)基因型對(duì)羔羊胴體性狀的影響

同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21基因變異對(duì)綿羊的胴體性狀也存在一定影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，等位基因B 對(duì)GR 值具有顯著影響，攜帶等位基因B 的群體較缺失群體的GR 值低，而GR 值是評(píng)價(jià)肉品質(zhì)脂肪含量的一項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)，肉制品中過(guò)高的脂肪含量會(huì)增加消費(fèi)者肥胖、糖尿病或心臟類疾病的風(fēng)險(xiǎn)[21]，因此，較低GR值的肉制品更為消費(fèi)者喜愛(ài)，等同于更高的市場(chǎng)利潤(rùn)。同時(shí)已有研究表明FGF21 蛋白因子在山羊中對(duì)脂肪合成具有一定的調(diào)控作用[22]，在人類中可以調(diào)節(jié)肥胖癥患者的葡萄糖和磷脂水平[6]，表明在綿羊育種過(guò)程中可將等位基因B 作為一個(gè)篩選綿羊胴體脂肪含量的候選因子，從而能夠根據(jù)市場(chǎng)所需培育瘦肉綿羊而獲益。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，檢測(cè)綿羊FGF21基因核苷酸變異共發(fā)現(xiàn)10 個(gè)新的核苷酸變異位點(diǎn)，且Intron-2 區(qū)的等位基因?qū)d羊的生長(zhǎng)性狀和胴體性狀均具有一定影響，等位基因A 和B 在綿羊育種過(guò)程中有效提高綿羊的生產(chǎn)性能，增加經(jīng)濟(jì)效益，可作為改善綿羊群體生產(chǎn)性能的分子標(biāo)記依據(jù)。