許金根，靳二輝，顧有方，王重龍，李慶崗*

（1.安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽鳳陽(yáng) 233100；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031）

繁殖性狀是豬重要的經(jīng)濟(jì)性狀，對(duì)其遺傳改良可明顯提高產(chǎn)仔數(shù)和經(jīng)濟(jì)效益。在當(dāng)前由非洲豬瘟疫情導(dǎo)致國(guó)內(nèi)豬存欄量下降的背景下，提高產(chǎn)仔數(shù)對(duì)我國(guó)生豬產(chǎn)能恢復(fù)有積極意義。但豬的產(chǎn)仔數(shù)屬于低遺傳力性狀，通過(guò)常規(guī)育種措施遺傳進(jìn)展緩慢，可利用分子標(biāo)記輔助選擇加速豬繁殖性狀的改良進(jìn)程。雌激素受體（Estrogen Receptor，ESR）通過(guò)與雌激素結(jié)合而影響雌性動(dòng)物的生殖力、繁殖周期、胚胎發(fā)育等[1]。卵泡刺激素（Follicle-stimulating Hormone，F(xiàn)SH）具有促進(jìn)動(dòng)物顆粒細(xì)胞增生和卵泡液分泌，以及促進(jìn)雌激素合成與分泌等作用，由α和β亞基構(gòu)成，其生物學(xué)特異性由β亞基決定[2]。因此，ESR和FSHβ被認(rèn)為是調(diào)控豬產(chǎn)仔數(shù)的重要功能候選基因。研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因的PvuII多態(tài)位點(diǎn)與中外豬種（如：太湖豬、大白豬）的繁殖性狀相關(guān)[3-4]，F(xiàn)SHβ基因的多態(tài)性與豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)[5]。另外，也有研究者聯(lián)合分析ESR基因和FSHβ基因?qū)Σ煌i種繁殖性狀的影響[6-7]。巴克夏豬是肉質(zhì)優(yōu)良的國(guó)外瘦肉型豬種，屬毛色呈六端白的黑豬，與我國(guó)地方黑豬雜交可以生產(chǎn)兼有地方豬種風(fēng)味和適度瘦肉率的精品黑豬[8]?；魤酆谪i屬于淮豬的一個(gè)類群，具有繁殖力高、肉質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，可用于純種或與巴克夏豬雜交生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黑豬肉[9]。國(guó)內(nèi)外研究者已對(duì)豬ESR基因和FSHβ基因多態(tài)性進(jìn)行大量檢測(cè)，主要集中于國(guó)外的杜洛克豬、長(zhǎng)白豬、大白豬以及我國(guó)多個(gè)地方豬種，但對(duì)巴克夏豬和霍壽黑豬的研究較少。我國(guó)地方豬種的產(chǎn)仔數(shù)一般高于國(guó)外引進(jìn)豬種，是研究豬繁殖性能的寶貴實(shí)驗(yàn)材料。通過(guò)比較中外豬種繁殖性狀候選基因多態(tài)性的分布特征，不僅為解析兩者繁殖性能的遺傳差異提供理論依據(jù)，還能為開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記用于我國(guó)地方豬種及其雜交群體產(chǎn)仔數(shù)的輔助選擇積累基礎(chǔ)資料。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)巴克夏豬、霍壽黑豬及其雜交后代ESR基因和FSHβ基因多態(tài)性，并研究這2 個(gè)基因多態(tài)性在不同豬群中的分布差異，為尋找提高豬繁殖性能的分子遺傳標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 采集32 頭巴克夏豬、48 頭霍壽黑豬和105 頭雜交后代（巴克夏豬♂× 霍壽黑豬♀）的耳組織樣本，保存于75%酒精。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker 購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，限制性內(nèi)切酶PvuII 購(gòu)自NEB 公司。主要儀器：核酸蛋白濃度測(cè)定儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）、梯度PCR 儀（德國(guó)Eppendorf 公司）、凝膠電泳成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.3 基因組DNA 的提取 采用常規(guī)酚/ 氯仿法提取豬基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，將其稀釋到100 ng/μL，于4℃保存待用。

1.4 PCR 擴(kuò)增 豬ESR基因擴(kuò)增引物參照Short 等[10]設(shè)計(jì)、FSHβ基因擴(kuò)增引物參照趙要風(fēng)等[5]設(shè)計(jì)，具體序列見(jiàn)表1。

表1 豬ESR 基因和FSHβ 基因PCR 擴(kuò)增引物

PCR 反應(yīng)體系：1 μL DNA，10 μL 2×Taq PCR Μaster Mix，上、下游引物各1 μL（10 mmol/mL），加ddH2O至終體積20 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸8 min。

1.5 基因多態(tài)性檢測(cè) 豬ESR基因的PCR產(chǎn)物酶切體系共10 μL：PCR 產(chǎn)物5 μL，限制性內(nèi)切酶PvuII（10 U/μL）0.5 μL，10×Buffer 1 μL，ddH2O 3.5 μL。37℃酶切4 h 后，經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)進(jìn)行分型。豬FSHβ基因多態(tài)性由片段插入形成，PCR 產(chǎn)物直接經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分型。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 用Popgene 32 軟件統(tǒng)計(jì)豬ESR、FSHβ的基因頻率、基因型頻率，以及遺傳多態(tài)性指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 豬ESR基因和FSHβ基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果 豬ESR基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PvuII 酶切后，產(chǎn)生等位基因A（120 bp）和B（55、65 bp），并檢測(cè)到AA、AB 和BB 基因型（圖1）。豬FSHβ基因經(jīng)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生等位基因A（500 bp）和B（220 bp），并檢測(cè)到AA、AB 和BB 基因型（圖2）。

圖1 豬ESR 基因PCR 產(chǎn)物Pvu II 酶切檢測(cè)

圖2 豬FSHβ 基因PCR 產(chǎn)物檢測(cè)

2.2 豬ESR基因多態(tài)性的基因型頻率和基因頻率 如表2 所示，巴克夏豬ESR基因僅檢測(cè)到AA 型；霍壽黑豬ESR基因檢測(cè)到3 種基因型，AB 和BB 型頻率高于AA 型，等位基因B 頻率高于A；巴克夏豬×霍壽黑豬ESR基因檢測(cè)到3 種基因型，AB 型頻率依次高于AA和BB 型，等位基因A 頻率高于B。

表2 豬ESR 基因的基因型頻率和基因頻率

2.3 豬FSHβ基因多態(tài)性的基因型頻率和基因頻率 如表3 所示，巴克夏豬FSHβ基因檢測(cè)到3 種基因型，BB 型頻率依次高于AB 和AA 型，等位基因B 頻率高于A；霍壽黑豬FSHβ基因檢測(cè)到3 種基因型，AB 型頻率高于BB 和AA 型，等位基因B 頻率略高于A；巴克夏豬× 霍壽黑豬FSHβ基因檢測(cè)到3 種基因型，AB型頻率依次高于BB 和AA 型，等位基因B 頻率高于A。

表3 豬FSHβ 基因的基因型頻率和基因頻率

2.4 豬ESR基因的遺傳多態(tài)性 如表4 所示，巴克夏豬沒(méi)有多態(tài)；霍壽黑豬的純合度（0.595 7）高于雜合度（0.404 3），有效等位基因數(shù)為1.678 7，SNP 處于中度多態(tài)（0.25

表4 豬ESR 基因的遺傳多態(tài)性

2.5 豬FSHβ基因的遺傳多態(tài)性 如表5 所示，巴克夏豬的純合度（0.658 2）高于雜合度（0.341 8），有效等位基因數(shù)為1.519 3，SNP 處于中度多態(tài)（0.25

表5 豬FSHβ 基因的遺傳多態(tài)性

3 討 論

作為調(diào)控豬繁殖性狀的功能候選基因，ESR基因和FSHβ基因多態(tài)性已在國(guó)內(nèi)外多個(gè)豬種中進(jìn)行過(guò)檢測(cè)。本研究首次報(bào)道了霍壽黑豬、巴克夏豬×霍壽黑豬ESR基因和FSHβ基因的多態(tài)性。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)ESR基因PvuII 酶切位點(diǎn)多態(tài)性分析表明，32 頭巴克夏豬僅檢測(cè)到AA 型，可能是因樣本量較少導(dǎo)致未檢測(cè)到AB 和BB 型；48 頭霍壽黑豬以AB和BB 型為主，等位基因B 頻率較高。蘭旅濤等[11]研究發(fā)現(xiàn)，國(guó)外引進(jìn)品種杜洛克豬、長(zhǎng)白豬、大白豬ESR基因的PvuII 酶切位點(diǎn)都以AA 和AB 型為主，等位基因A 頻率較高。李明洲等[3]研究表明，我國(guó)地方品種成華豬、內(nèi)江豬、太湖豬ESR基因的PvuII 酶切位點(diǎn)，均是AB 和BB 型為主，等位基因B 頻率較高。曹晶晶等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因PvuII 多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率在9 個(gè)中外豬種中存在差異，總體上是國(guó)外豬種等位基因A 頻率占優(yōu)勢(shì)，而我國(guó)地方豬種等位基因B 頻率占優(yōu)勢(shì)。本研究表明，ESR基因PvuII 位點(diǎn)國(guó)外品種巴克夏豬優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳，而地方品種霍壽黑豬優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锽，這與上述研究結(jié)果較一致。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)105 頭巴克夏豬×霍壽黑豬ESR基因的AB 和AA型頻率高于BB 型，等位基因A 頻率高于B，這主要是由于霍壽黑豬導(dǎo)入巴克夏豬血統(tǒng)，提高了等位基因A的頻率。另外，ESR基因的PvuII 酶切位點(diǎn)與豬產(chǎn)仔數(shù)的Meta 分析表明，豬產(chǎn)仔性狀的有利等位基因?yàn)锽，有利基因型為BB 型[13]。本研究中，巴克夏豬（產(chǎn)仔數(shù)低）與霍壽黑豬（產(chǎn)仔數(shù)高）ESR基因PvuII 位點(diǎn)基因頻率分布存在明顯不同，故推測(cè)該基因位點(diǎn)對(duì)霍壽黑豬的產(chǎn)仔性能有一定影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，霍壽黑豬、巴克夏豬× 霍壽黑豬ESR基因PvuII 位點(diǎn)均處于中度多態(tài)，表明這2 個(gè)豬群該基因位點(diǎn)具有選育潛力?；魤酆谪i是分布在安徽省的優(yōu)良地方豬種，提高霍壽黑豬的產(chǎn)仔數(shù)有助于對(duì)其性能進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。巴克夏豬×霍壽黑豬雜交后代除了直接用于商品豬生產(chǎn)，也可以將其留種用于二元母豬生產(chǎn)或以此為基礎(chǔ)開(kāi)展雜交育種培育黑豬新品系。因此，后期可以開(kāi)展ESR基因與霍壽黑豬、巴克夏豬×霍壽黑豬產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性研究，從而提高霍壽黑豬純種繁育及其與巴克夏豬雜交群體的繁殖性能。

本研究對(duì)FSHβ基因多態(tài)性分析表明，巴克夏豬、霍壽黑豬、巴克夏豬×霍壽黑豬3 個(gè)群體中的FSHβ基因多態(tài)性均處于中度多態(tài)，且都是AB 和BB 型頻率較高，等位基因B 頻率較高。蘇先敏等[14]研究表明，大白豬、長(zhǎng)白豬和杜洛克豬FSHβ基因均是BB 型占優(yōu)勢(shì)，等位基因B 占優(yōu)勢(shì)。張曉東等[15]研究發(fā)現(xiàn)，安慶六白豬、定遠(yuǎn)豬、皖南黑豬、皖南花豬4 個(gè)地方豬種FSHβ基因都以等位基因A 為優(yōu)勢(shì)。戴麗荷等[16]研究也表明，除臺(tái)系杜洛克豬和嵊縣花豬外，國(guó)外豬種（大約克豬、長(zhǎng)白豬、美系杜洛克豬）的等位基因B 頻率較高，而地方豬種（金華豬、嘉興黑豬、八眉豬、巴馬香豬）FSHβ基因都是等位基因A 占優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)中，巴克夏豬和霍壽黑豬FSHβ基因頻率分布趨勢(shì)相同，均是等位基因B 頻率占優(yōu)勢(shì)，巴克夏豬與上述國(guó)外引進(jìn)豬種研究結(jié)果相同，但霍壽黑豬與上述地方豬種研究結(jié)果不同，這可能是豬種遺傳背景差異造成的。趙要風(fēng)等[5]研究發(fā)現(xiàn)，豬FSHβ基因插入產(chǎn)生的多態(tài)性，BB 型個(gè)體比AA 型平均每胎多產(chǎn)仔1.5 頭。甘乾福等[17]研究表明，杜洛克豬、長(zhǎng)白豬、大白豬FSHβ基因都以BB 基因型和等位基因B 占優(yōu)勢(shì)，但該多態(tài)位點(diǎn)對(duì)初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬的總產(chǎn)仔數(shù)無(wú)顯著影響。因此，F(xiàn)SHβ基因多態(tài)性能否用于霍壽黑豬及巴克夏豬×霍壽黑豬群體繁殖性能的選育，有待進(jìn)一步研究。

綜合上述研究結(jié)果可見(jiàn)，調(diào)控豬產(chǎn)仔數(shù)的因素較多，除了ESR基因和FSHβ基因，可能還受其他基因影響[18]。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巴克夏豬ESR基因Pvu II位點(diǎn)只檢測(cè)到AA 型，霍壽黑豬ESR基因檢測(cè)到3 種基因型，B 為優(yōu)勢(shì)等位基因，巴克夏豬× 霍壽黑豬ESR基因檢測(cè)到3 種基因型，A 為優(yōu)勢(shì)等位基因。巴克夏豬、霍壽黑豬、巴克夏豬×霍壽黑豬FSHβ基因均檢測(cè)到3 種基因型，都是B 為優(yōu)勢(shì)等位基因。