肖 成，薛佳佳,2，王 晶,3，柳儉強，于永生，張立春，馬惠海，金海國*，曹 陽*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，吉林公主嶺 136100；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，吉林長春 130000；3.延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉 133000）

小尾寒羊是我國地方品種，具有高繁殖力、耐寒、抗逆性強等特點，但其肉質(zhì)不如國外其他肉羊品種[1]。隨著人們生活水平的提高，高品質(zhì)羊肉越來越受消費者歡迎，因此提高小尾寒羊肉品質(zhì)以及選育高品質(zhì)肉羊品種是目前需要解決的一大難題。肌內(nèi)脂肪含量與肉色、肉嫩度及品質(zhì)密切相關(guān)，提高其肌內(nèi)脂肪含量能夠顯著提升肉質(zhì)。肌內(nèi)脂肪含量增加是新的脂肪細胞產(chǎn)生以及已有脂肪細胞增殖肥大的過程。新脂肪細胞形成及成熟需要經(jīng)歷細胞增殖和分化2 個階段，期間大量基因、激素、轉(zhuǎn)錄因子等參與調(diào)控[2]。因此，遺傳因素是影響肌內(nèi)脂肪含量形成及脂肪細胞分化的關(guān)鍵因素，尋找參與小尾寒羊脂肪形成的新候選基因成為關(guān)鍵。本實驗室前期通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊前體脂肪細胞發(fā)育為成熟脂肪細胞過程中，存在大量的差異表達基因，其中S100 鈣結(jié)合蛋白A1（S100 Calcium Binding Protein A1，S100A1）基因存在差異表達（未發(fā)表），但具體表達規(guī)律不清楚。S100A1 是一種鈣結(jié)合蛋白，參與心肌收縮、線粒體代謝，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子平衡、血管功能。大量研究證明，S100A1基因主要與肌肉形成、心肌疾病、皮膚病及腫瘤癌癥有關(guān)[3-8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，S100A1基因在小鼠脂肪細胞分化過程中差異表達[9]。但S100A1基因在其他物種與脂肪相關(guān)的研究仍不豐富。由于實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，S100A1基因可能與脂肪代謝有關(guān)（測序數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此具有一定的研究價值。本文以小尾寒羊為動物樣本，首先檢測S100A1基因在不同日齡小尾寒羊脂肪組織中的表達差異，同時探索了S100A1基因在脂肪細胞分化過程中的表達規(guī)律，之后從分子層面研究其基因結(jié)構(gòu)以及突變位點并與實際生產(chǎn)性狀做關(guān)聯(lián)分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究實驗動物為來自吉林省農(nóng)業(yè)科學院動物生物技術(shù)研究所飼養(yǎng)的3 日齡和2 月齡小尾寒羊各1 只，6 月齡小尾寒羊63 只。3 日齡小尾寒羊用于提取脂肪組織RNA，6 月齡小尾寒羊3 只，用于提取各組織總RNA。60 只6 月齡小尾寒羊血液用于基因組提取。2 月齡小尾寒羊用來分離前體脂肪細胞。

1.2 主要試劑 血液基因組試劑盒來自AXYGEN 生物公司；細胞培養(yǎng)皿來自corning 公司；PBS 緩沖液、胰蛋白酶、膠原酶、胰島素、地塞米松等均來自Sigma 公司；TRIZOL 來自Invitrogen 公司；PCR 預(yù)混酶來自康為世紀生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 Maker 購自TaKaRa 生物有限公司；PCR 引物及測序服務(wù)由蘇州金唯智生物科技有限公司提供；LightCycler 480 SYBR Green I Master 由羅氏（中國）公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 分離小尾寒羊前體脂肪細胞并誘導(dǎo) 人道處死2 月齡小尾寒羊，無菌取腹股溝處白色脂肪組織，將組織剪成1 mm3方塊。膠原酶II 消化組織，經(jīng)200 目及400 目濾網(wǎng)，過濾出未消化的組織及雜細胞。1 500 r/min 離心15 min，去除上清液，完全培養(yǎng)液重懸細胞并接種到35 mm 培養(yǎng)皿中，6 h 細胞貼壁，12 h 換液，除掉雜細胞及死細胞的影響。每48 h 換液，待細胞長滿培養(yǎng)皿，胰酶消化細胞，傳代培養(yǎng)。第4 代細胞進行體外誘導(dǎo)，胰島素、地塞米松以及IBMX 混合培養(yǎng)液作為誘導(dǎo)I 液誘導(dǎo)細胞，48 h 換誘導(dǎo)II 液（含胰島素的完全培養(yǎng)基），48 h 后換完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)直到顯微鏡下看到細胞出現(xiàn)脂滴，油紅O 染色驗證成熟的脂肪細胞。

1.3.2 提取小尾寒羊血液DNA 及各組織總RNA 取250μL 羊血進行基因組提取，操作按照AXYGEN 血液基因組提取試劑盒的說明書進行。人道處死6 月齡小尾寒羊3 只，無菌取下肌肉、脂肪、肺、脾、腸、心、肝組織。處死3 日齡小尾寒羊1 只，無菌取其腹部皮下脂肪組織，冷凍于液氮中。取黃豆粒大小組織進行液氮研磨，研磨后組織粉末用TRIZOL 處理，根據(jù)說明書，提取各組織總RNA。RNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測合格后，根據(jù)TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄酶說明書體外合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL：5×PrimeScript RT Μaster Μix 2 μL、Total RNA 500 ng，RNase Free ddH2O 補充至10 μL。反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。將cDNA 用雙蒸水稀釋10 倍，用于后續(xù)實驗。

1.3.3 引物設(shè)計、PCR 產(chǎn)物測序 根據(jù)Genbank 中預(yù)測的綿羊S100A1基因組及mRNA 序列（NC_040252.1；XM_00 4002529.3）、內(nèi)參基因GAPDH序列（NM_001190390.1），利用Primer 5 軟件設(shè)計得到S100A1基因CDS 區(qū)引物以及各外顯子引物、實時熒光定量PCR 引物序列（表1）。

表1 S100A1 基因引物序列

1.3.4 引物特異性驗證 引物退火溫度與延伸時間見表1。擴增反應(yīng)體系為20 μL：預(yù)混酶10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模 板1 μL、ddH2O 8 μL；擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸（延伸時間見表1），35 個循環(huán)；72℃延伸8 min，4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳實驗，條帶單一的PCR 引物可用于后續(xù)實驗。

1.3.5 連接載體及測序 將S100A1-CDS 以及基因的5個外顯子PCR 產(chǎn)物進行膠回收?；厥债a(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接體系為10 μL：T 載體1 μL、膠回收產(chǎn)物為0.1～0.3 pmol、補充到10 μL；4℃過夜。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，冰浴30 min，42℃水浴90 s，冰浴5 min，37℃搖床搖1 h，以激活感受態(tài)細胞。取菌液100 μL 均勻涂到固體培養(yǎng)皿中，正面朝上放置在37℃培養(yǎng)箱30 min，然后將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，正面朝下繼續(xù)培養(yǎng)16 h。挑克隆進行擴大培養(yǎng)，37℃搖床搖4 h 后進行菌液PCR 驗證，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳實驗，條帶單一明亮的菌液進行測序。

1.3.6 生物信息學分析S100A1基因結(jié)構(gòu) 小尾寒羊S100A1基因CDS 區(qū)及外顯子測序結(jié)果與網(wǎng)上預(yù)測序列進行比對。ExPASy 網(wǎng)站中ProParam 程序分析S100A1蛋白一級結(jié)構(gòu)、理化特性；PROTEAN 軟件預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；Phyre 2 程序預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)；Signal IP 預(yù)測信號肽；PSORT II 進行蛋白亞細胞定位。

1.3.7 實時熒光定量PCR 檢測小尾寒羊S100A1基因各組織表達譜，細胞各時期表達規(guī)律。qRT-PCR 體系為20 μL：Light Cycler 480 SYBR Green ⅠMaster（2×）10 μL、ddH2O 8 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)程序：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃20 s共40 個循環(huán)，95℃ 5 s，65℃ 1 min，40℃ 10 s，每組實驗重復(fù)3 次。Roche Lightcycler 480 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計分析 每組實驗重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用GraphPad Prism 軟件作圖，利用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗或單因素方差分析，顯著性水平定為P<0.05，極顯著水平定為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 小尾寒羊S100A1基因各組織RNA 表達譜 小尾寒羊各組織總RNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定，可以進行后續(xù)實驗。如圖1 所示，S100A1基因在心臟中表達量最高，其次是肺、腸、脾、腎、肝、肌肉、脂肪；6 月齡脂肪S100A1基因表達量顯著高于3 日齡。

2.2 小尾寒羊前體脂肪細胞培養(yǎng)與分化 小尾寒羊前體脂肪細胞貼壁之前為球狀，6 h 后細胞開始貼壁，呈不規(guī)則梭型。6 孔板培養(yǎng)細胞在第5 天細胞長滿，可以進行體外誘導(dǎo)分化，分化后細胞體積膨大，內(nèi)部出現(xiàn)脂滴。油紅O 染色鑒定成熟脂肪細胞，脂滴能夠被染成紅色，如圖2 所示。

圖1 小尾寒羊各組織S100A1 基因及不同日齡相對表達量

圖2 小尾寒羊成熟脂肪細胞油紅O 染色圖

2.3 小尾寒羊S100A1基因在細胞分化期間的表達規(guī)律在小尾寒羊脂肪細胞分化過程中，分別于第0、2、4、6、8、10、12 天提取總RNA，進行實時熒光定量PCR 分析發(fā)現(xiàn)，S100A1基因在細胞長滿培養(yǎng)皿時表達量出現(xiàn)顯著升高，加入體外誘導(dǎo)劑，基因出現(xiàn)顯著降低，最后隨著細胞分化的開始，S100A1基因相對表達量顯著升高，并保持一定水平（圖3）。

圖3 小尾寒羊細胞分化過程S100A1 基因相對表達量

2.4 小尾寒羊S100A1基因編碼區(qū)及外顯子區(qū)克隆以及生物信息學分析 以小尾寒羊肝臟組織cDNA 為模板，克隆出S100A1基因的編碼區(qū)，測序結(jié)果見圖4。小尾寒羊S100A1基因與NCBI 網(wǎng)站上預(yù)測的結(jié)果一致，沒有出現(xiàn)突變。通過混池PCR 以及sanger 測序，成功克隆S100A1基因5 個外顯子，將測序序列與網(wǎng)站公布序列對比發(fā)現(xiàn)，5 個外顯子均不存在SNP 突變。編碼區(qū)序列經(jīng)生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)，S100A1基因CDS 區(qū)具有285 bp 的開放閱讀框，編碼94 個氨基酸。S100A1 蛋白分子量為10.52 ku；理論等電點4.39，為酸性蛋白；穩(wěn)定系數(shù)8.96，為穩(wěn)定蛋白；平均親水性-0.38，為親水蛋白；S100A1 蛋白氨基酸組成見表2。信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，蛋白為非分泌蛋白；S100A1 蛋白表達預(yù)測主要定位在細胞質(zhì)52.2%、細胞核17.4%、線粒體13%、高爾基體4.3%、空泡4.3%；S100A1蛋白二級結(jié)構(gòu)存在4 個α-螺旋、2 個β-折疊、6 個轉(zhuǎn)角、2 個卷曲（圖2）；蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測一致，基本結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜，但會形成復(fù)雜的三維空間結(jié)構(gòu)（圖6），其蛋白功能主要由二級結(jié)構(gòu)及三級空間結(jié)構(gòu)決定。

3 討 論

圖4 小尾寒羊S100A1 基因CDS 區(qū)序列比對圖

表2 小尾寒羊S100A1 蛋白氨基酸組成

圖5 小尾寒羊S100A1 蛋白二級結(jié)構(gòu)

圖6 小尾寒羊S100A1 蛋白三級結(jié)構(gòu)

S100 蛋白家族具有一定的保守性，家族成員結(jié)構(gòu)類似、分子量為10～12 ku[10]。它具有細胞和組織的表達特異性，同時具有多種生理功能[11]。S100A1 是S100 蛋白家族成員之一，它能夠與鈣離子結(jié)合，參與機體多種生理功能。目前有關(guān)S100A1基因與脂肪相關(guān)的研究很少，所以本文探索了S100A1基因在羊脂肪代謝過程中的表達規(guī)律，并尋找基因突變位點。實驗表明，S100A1基因在小尾寒羊心臟組織的表達量最高。S100A1基因具有結(jié)合鈣離子、調(diào)節(jié)心肌收縮的功能，本實驗結(jié)果也說明了這一點，同時也間接增加了實驗數(shù)據(jù)的可信度。相比于其他組織，S100A1基因在脂肪組織的相對表達量較少，但S100A1基因的表達量隨著羊日齡的增加以及脂肪組織中新細胞增生肥大而出現(xiàn)顯著升高。這說明S100A1基因雖然不在脂肪組織中大量表達，但S100A1基因參與了動物脂肪發(fā)育過程。同時S100A1基因在綿羊脂肪細胞分化過程出現(xiàn)顯著變化，更加表明S100A1基因參與綿羊脂肪代謝過程。

為深入了解S100A1基因功能，研究探索了S100A1基因的結(jié)構(gòu)。由于NCBI 網(wǎng)站公布的綿羊S100A1基因為預(yù)測序列，所以本實驗克隆了小尾寒羊S100A1基因的實際序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)實際序列與預(yù)測序列一致，不存在突變，這說明S100A1基因序列相對保守。S100A1蛋白分子式C464H722N116O154S4，為酸性蛋白，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，由于編碼序列少，所以蛋白的二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜。在檢測基因組突變位點方面，可能由于測序樣本有限，S100A1基因5 個外顯子不存在SNP 位點，隨著樣本數(shù)增加，有可能檢測到存在的SNP 位點。同時，SNP 位點也可能出現(xiàn)在內(nèi)含子上，進而影響其發(fā)揮作用。雖然實驗沒有檢測到S100A1基因外顯子存在突變位點，但其他結(jié)果表明S100A1基因參與小尾寒羊脂肪細胞形成與發(fā)育。S100A1基因在脂肪細胞中發(fā)育的具體功能值得進一步探究。

4 結(jié) 論

S100A1基因CDS 序列285 bp，編碼94 個氨基酸，分子量為10.52 ku，為酸性親水穩(wěn)定蛋白，主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用。實驗證實了小尾寒羊S100A1基因在不同細胞分化階段及不同日齡脂肪組織差異表達。雖然小尾寒羊S100A1基因CDS 序列以及外顯子不存在突變，但仍然值得深入研究其在脂肪代謝上的功能。