趙易敏，張瑞門，鄧彥飛，程雋如，呂 巧，邢青華，謝炳坤，石德順，楊素芳*，韋英明

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，亞熱帶生物資源保護(hù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004；2.廣西畜牧研究所，廣西南寧 530001；3.廣西大學(xué)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，廣西南寧 530004）

隆林黃牛作為廣西三大良種黃牛之一，具有肌肉發(fā)達(dá)、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性好等特性，其體型雖較小，產(chǎn)肉量低，但皮薄骨細(xì)，肉質(zhì)細(xì)嫩，屠宰率和凈肉率相對(duì)高。據(jù)中國海關(guān)總署發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2019 年我國進(jìn)口肉類產(chǎn)品增長比較快，全年進(jìn)口豬肉210.8 萬t，同比增加75%；進(jìn)口牛肉165.9 萬t，同比增加59.7%。從人均年肉類消費(fèi)量來看，中國為50.3 kg、美國為98.6 kg、歐盟為69.6 kg，可見，中國仍具有較大增長空間。近年來，國人的飲食結(jié)構(gòu)正朝著高蛋白方向轉(zhuǎn)變，1995—2014 年我國居民人均牛肉購買量占肉類購買總量的比重從4.14%增加到6.46%，未來牛肉需求量還會(huì)逐步上升[1]?，F(xiàn)階段，隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化水平越來越高，隆林黃牛逐漸向肉用方向轉(zhuǎn)化，但其肉用性能還未得到充分的開發(fā)，需應(yīng)用動(dòng)物生物學(xué)技術(shù)來改良提升其肉用價(jià)值。目前，提高隆林黃牛產(chǎn)肉性能的研究尚處于起步階段，其肌生成過程中相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制研究較少[2-3]，因此，應(yīng)用基因表達(dá)生物技術(shù)研究影響隆林黃牛肌生成過程中的重要功能基因以建立隆林黃牛分子育種與基因改良技術(shù)具有重大意義。

組蛋白去乙酰化酶（HDACs）是在生物學(xué)進(jìn)化過程中高度保守的一類蛋白，在參與細(xì)胞凋亡、生長停滯、增殖分化等細(xì)胞進(jìn)程的同時(shí)，還在染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用[4]。Beharry[5]研究發(fā)現(xiàn)HDAC和HAT在多種肌肉萎縮模型中特異性均增加，但I(xiàn) 類HDAC表達(dá)增加是廢用性肌肉萎縮所特有的，說明特異性HDAC抑制劑在對(duì)抗肌肉萎縮方面可能比pan-HDAC抑制劑更有效；Montgomery 等[6]的研究表明，心臟特異性缺失HDAC2（包括HDAC1）會(huì)導(dǎo)致新生兒心律不齊，出現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病以及編碼骨骼肌特異性收縮蛋白和鈣通道的基因上調(diào)；Fan 等[7]研究表明，銜接蛋白APPL1 具有協(xié)調(diào)HDAC3調(diào)節(jié)小鼠棕色脂肪組織的生熱作用；2002 年，Ye[8]等首次報(bào)道，HDAC1與豬的肩部脂肪重、后腿重、頰重等主要分割性狀有顯著性聯(lián)系；Hu 等[9]研究發(fā)現(xiàn)HDAC5的催化結(jié)構(gòu)域具有調(diào)控功能，它在控制心肌細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。此外，HDACs家族基因還具有多種治療潛力，如在卵巢腫瘤研究中，HDAC9siRNA通過在體外和體內(nèi)抑制GC 細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制GC 腫瘤生長[10]；HDAC6/8/10抑制劑在高級(jí)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中有治療潛力[11]，HDAC11選擇性抑制劑則有治療肥胖和糖尿病的潛力[12]。

綜上所述，HDACs基因家族在人、小鼠等物種研究中都取得了相應(yīng)進(jìn)展[13-14]，但在廣西黃牛骨骼肌發(fā)育和肉品質(zhì)方面的研究較少。因此，本文研究了廣西隆林黃牛HDAC家族基因在骨骼肌組織及其來源成肌細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律，進(jìn)一步篩選具有調(diào)控骨骼肌發(fā)育作用的表觀遺傳修飾候選HDAC基因，為今后深入研究HDACs基因家族在黃牛肌肉生長發(fā)育中的功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為我國黃牛資源的保護(hù)、開發(fā)和使用提供生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織采集 選擇廣西崇左市寧明縣富練養(yǎng)牛場的隆林黃牛6 頭，用活體采樣手術(shù)器械采集6 月齡（n=3）、18 月齡（n=3）背最長肌肌肉組織，用PBS 緩沖液漂洗組織表面的血跡后剪成小塊放入凍存管后立即置于液氮罐中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并保存于-80℃冰箱備用。

1.2 主要試劑 分子生物學(xué)試劑：Trizol 試劑購自Invitrogen公司，瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Vazyme 公司。細(xì)胞生物學(xué)試劑：DMEM 高糖基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（GIBCO）、胎牛血清（FBS，GIBCO）、馬血清（HS，GIBCO）、胰酶等均購自Life 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 中牛HDACs家族基因序列，應(yīng)用Oligo 7.0 軟件設(shè)計(jì)HDAC家族基因特異性擴(kuò)增引物，用于熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，具體信息如表1 所示。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 在廣西南寧市魯班路肉聯(lián)廠收集黃牛胎兒（90 日齡），利用手術(shù)器械采集背最長肌組織，通過膠原酶消化法分離培養(yǎng)牛骨骼肌來源肌肉干細(xì)胞，經(jīng)過傳代后，一部分培養(yǎng)作為肌肉干細(xì)胞增殖期樣本（GM），一部分細(xì)胞用于成肌分化誘導(dǎo)（經(jīng)2% 馬血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)4 d）作為肌細(xì)胞分化期樣本（DM），剩余細(xì)胞凍存于廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室備用。

1.5 RNA 提 取和cDNA 第1 鏈的合成 采用Trizol 法提取6 月齡、18 月齡肌肉組織、胎兒骨骼肌來源肌肉干細(xì)胞樣本的總RNA，檢測濃度及純度后，篩選質(zhì)量合格的RNA 用于cDNA 合成。本實(shí)驗(yàn)利用兩步反轉(zhuǎn)法合成cDNA 第1 鏈。第1 步，去除基因組DNA：5 μL RNA，4 μL 4×gDNA wiper Μix 及7 μL 相應(yīng)的RNasefree ddH2O，42℃反應(yīng)2 min；第2 步，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在去除基因組產(chǎn)物中分別加入4 μL 5× HiScript III qRT SuperMix（反轉(zhuǎn)錄酶），程序?yàn)?7℃ 15 min、85℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 產(chǎn)物保存于-80℃冰箱。

表1 熒光定量PCR 基因引物合成序列

1.6 RT-qPCR 反應(yīng) 20 μL 反應(yīng)體系：2× ChamQTM Universal SYBR?qPCR Μaster Μix 10.0 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、cDNA 模板（110 ng/μL）1.0 μL、ddH2O 8.0 μL。qPCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s、60℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔt計(jì)算基因的表達(dá)情況。對(duì)所得數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7 作圖，用SPSS Statistics 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）表示結(jié)果，數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃牛胎兒骨骼肌來源肌肉干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和誘導(dǎo) 本實(shí)驗(yàn)利用膠原酶消化法分離得到黃牛胎兒骨骼肌來源肌肉干細(xì)胞（圖1-A），在細(xì)胞分化4 d 時(shí)，細(xì)胞DAPI 熒光染色顯示誘導(dǎo)第4 天有大量肌管形成（圖1-B）。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)通過Trizol 法純化獲得廣西黃牛胎兒骨骼肌來源肌肉干細(xì)胞增殖期樣本（GM）和分化期樣本（DM）的總RNA（圖2-B），從圖中可以觀察到清晰的特異性條帶，說明獲得的RNA 可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在檢測成肌分化標(biāo)志基因MyoD1、MyoG和MyHC的表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，qPCR 結(jié)果表明MyoD1、MyoG、MyHC的mRNA 在分化第4 天相較于對(duì)照組都顯著升高（圖1-C）。由此可見，本次實(shí)驗(yàn)成功建立牛骨骼肌來源肌肉干細(xì)胞技術(shù)培養(yǎng)體系，為后期研究提供了細(xì)胞模型。

2.2 黃牛HDACs家族基因的肌肉組織表達(dá)規(guī)律 通過Trizol 法純化獲得廣西隆林黃牛6 月齡和18 月齡背最長肌肌肉組織總RNA（圖2-A），從圖中可以觀察到清晰的特異性條帶，說明獲得的RNA 可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，RT-PCR 實(shí)驗(yàn)顯示，HDACs家族基因擴(kuò)增序列特異性良好（圖3），說明可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖4 顯示，HDACs家族基因在18 月齡背最長肌組織的表達(dá)顯示上調(diào)，除了HDAC7、HDAC8、HDAC10基因在2 個(gè)階段的肌肉組織表達(dá)沒有顯著差異外，其余HDACs家族基因的表達(dá)都顯著上調(diào)，其中，HDAC11在18 月齡階段肌肉組織的表達(dá)量最高（P<0.000 1）。由此可見，HDACs在黃牛骨骼肌發(fā)育過程中可能具有重要的調(diào)控作用，可作為后續(xù)骨骼肌發(fā)育研究中的表觀遺傳修飾的候選基因。

圖1 牛胎兒骨骼肌來源肌細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)

圖2 隆林黃牛肌肉組織、肌細(xì)胞RNA 的特異性條帶

圖3 牛HDACs 家族基因RT-PCR 電泳圖

2.3 黃牛HDACs家族基因在成肌細(xì)胞增殖和分化階段的表達(dá)規(guī)律 本實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR 數(shù)據(jù)顯示，除了HDAC7基因在2 個(gè)細(xì)胞階段的表達(dá)量沒有顯著差異之外，其余HDACs家族基因在肌肉干細(xì)胞增殖階段的表達(dá)量均顯著高于肌肉干細(xì)胞分化階段（圖5）。與圖4的數(shù)據(jù)比較，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC9、HDAC11在18 月齡時(shí)期顯著上調(diào)，并且在細(xì)胞增殖過程保持高表達(dá)水平，由此可見，這些基因在黃牛骨骼肌來源成肌細(xì)胞增殖過程中可能具有重要的調(diào)控作用，可作為后續(xù)骨骼肌發(fā)育研究中的表觀遺傳修飾的候選基因。

圖4 HDACs 家族基因在隆林黃牛不同生長階段的背最長肌組織的表達(dá)譜

圖5 HDACs 家族基因在牛胎兒骨骼肌來源肌細(xì)胞的表達(dá)譜

3 討 論

目前，隨著生活水平的提高，國內(nèi)牛肉產(chǎn)量和品質(zhì)的供應(yīng)已無法滿足人們需求，廣西肉牛產(chǎn)業(yè)還處于初級(jí)發(fā)展階段，如何提高牛肉產(chǎn)量和肉質(zhì)值得探討[15]。一直以來，國內(nèi)對(duì)動(dòng)物骨骼肌發(fā)育的研究取得了一系列進(jìn)展，明確了生肌調(diào)控因子家族基因（MRFs），肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（MEF2）、肌生成素、雙肌臀基因，以及非編碼RNA：miRNA、lncRNA、circRNA 等眾多分子在骨骼肌發(fā)育調(diào)控中的重要地位[16]。

組蛋白脫乙?；福℉DACs）是一類酶，可從蛋白質(zhì)上的賴氨酸中去除乙酰基，而它們?cè)谡{(diào)控家畜動(dòng)物生長發(fā)育研究方面鮮有報(bào)道，因此本研究結(jié)果是該領(lǐng)域進(jìn)展中的一個(gè)補(bǔ)充。在人類中，HDAC1～11分為3 類：I類HDAC包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8，主要存在于細(xì)胞核中，使組蛋白發(fā)生脫乙?；痆17]；II 類HDAC進(jìn)一步分 為IIa 類（HDAC、HDAC5、HDAC7和HDAC9）和IIb（HDAC6和HDAC10）同工型[18]；III 類HDAC（HDAC11）在腦、腎和睪丸等組織中有表達(dá)[19]。從本研究結(jié)果分析，HDAC1～11家族基因成員在牛的不同生長階段表現(xiàn)出不同的表達(dá)規(guī)律，而這些基因分子在廣西隆林黃牛18 月齡骨骼肌組織的表達(dá)均高于6 月齡時(shí)期；值得一提的是，牛HDACs家族基因分類、細(xì)胞亞定位、組織特異性與人類HDACs家族基因的異同需要進(jìn)一步探究證實(shí)。

在本研究獲得的廣西隆林黃牛胎兒骨骼肌來源肌肉干細(xì)胞中，HDAC1～11在肌肉干細(xì)胞分化進(jìn)程中基因表達(dá)顯示下調(diào)，而在增殖過程中維持表達(dá)，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC9、HDAC11基因表達(dá)差異變化顯著。前述結(jié)果足以證明，HDAC1～11家族基因成員均參與了廣西隆林黃牛骨骼肌發(fā)育過程，而這些差異表達(dá)分子可能在肌肉干細(xì)胞維持增殖過程發(fā)揮調(diào)控作用。以往研究報(bào)道為后續(xù)研究提供了一些線索，如在小鼠骨骼肌肌萎縮研究中發(fā)現(xiàn)，HDAC4利用肌球蛋白重鏈（MyHC）等結(jié)合底物進(jìn)而調(diào)節(jié)骨骼肌組織的代謝途徑，暗示了其他IIa 類HDAC基因可能參與骨骼肌代謝途徑或者其他生物過程[20]。另外，肥胖如何影響骨骼肌性能是研究者們思考的又一個(gè)重要科學(xué)問題，謝謹(jǐn)?shù)萚21]研究結(jié)果顯示，AMPK 活性降低會(huì)促進(jìn)II 類組蛋白脫乙?；福℉DAC5）介導(dǎo)的對(duì)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（MEF2）的抑制，從而影響肌肉收縮動(dòng)能的變化。這些發(fā)現(xiàn)為深入探究牛HDACs基因在調(diào)控肌肉發(fā)育功能機(jī)制中的作用提供了研究視角。

未來可選擇HDAC5、HDAC11等顯著變化分子深入探討骨骼肌發(fā)育體內(nèi)體外調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步開展相關(guān)骨骼肌發(fā)育調(diào)控中HDACs的表觀遺傳修飾作用：第一，立足DNA 順式調(diào)控元件（啟動(dòng)子、增強(qiáng)子），解析組蛋白脫乙?；概c上游調(diào)控的內(nèi)在聯(lián)系，找到調(diào)控骨骼肌發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑；第二，聯(lián)系反式作用因子和生肌調(diào)控關(guān)鍵基因，聯(lián)合組蛋白脫乙?；傅谋碛^修飾作用，把肌肉干細(xì)胞增殖、分化過程中影響因素及其關(guān)鍵角色進(jìn)行挖掘；第三，組蛋白脫乙酰基酶與circRNA 等非編碼RNA 領(lǐng)域調(diào)控肌肉干細(xì)胞的發(fā)育關(guān)鍵信息值得挖掘，例如組蛋白脫乙?；甘欠裼绊慶ircRNAs 對(duì)靶基因的調(diào)控或者產(chǎn)生編碼多肽?？傊?，這些變化是否會(huì)影響肌肉干細(xì)胞發(fā)育中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化、產(chǎn)肌性能的變化，值得后續(xù)深入探討。

4 結(jié) 論

本研究成功挖掘HDAC1～11家族基因在隆林黃牛6 月齡和18 月齡背最長肌組織以及肌肉干細(xì)胞的表達(dá)規(guī)律，為今后挖掘HDAC5、HDAC11等候選基因調(diào)控廣西黃牛肌肉干細(xì)胞的關(guān)鍵信息奠定了理論基礎(chǔ)。