嚴樟華，徐 弢，周見軍，饒武敏，李小慧

(撫州市疾病預(yù)防控制中心檢驗科，江西 撫州 344000)

因感染結(jié)核分枝桿菌(MTB))而引起的結(jié)核病是危害人類健康的重大感染病之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)2019年數(shù)據(jù)表明中國是10個全球結(jié)核病耐多藥流行嚴重國家之一，2018年新發(fā)病例在80萬左右[1]，中國結(jié)核病在28種傳染病中的發(fā)病率和死亡率位居第二位[2]。結(jié)核病是一種慢性傳染病，治愈的難度在于藥物治療的方案持續(xù)時間長且復(fù)雜[1]，容易造成耐藥結(jié)核病的發(fā)生，耐多藥和多耐藥結(jié)核病的治愈難度大、耗時耗費，且具有治愈率低、病死率高等特點，嚴重威脅我國公民健康。2005—2013年江西省結(jié)核病年均發(fā)病率為91.53/10萬[3]，2005—2011年撫州市肺結(jié)核發(fā)病人數(shù)穩(wěn)居甲乙類法定傳染病第一位[4]。本調(diào)查通過對撫州市2015—2019年結(jié)核分枝桿菌耐藥性數(shù)據(jù)進行分析，旨在為撫州市耐藥結(jié)核病的防治及管理提供科學依據(jù)，以便有效地控制結(jié)核病的耐藥、傳播及流行。

1 材料與方法

1.1 標本來源

2015—2019年撫州市疾病預(yù)防控制中心共收集轄區(qū)各縣區(qū)涂陽肺結(jié)核患者臨床分離菌株528株，經(jīng)對硝基苯甲酸(PNB)、噻吩二羧酸肼(TCH)初步鑒定結(jié)核分枝桿菌491株，非結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌29株，無結(jié)果8株。在鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株中，來源于初治患者469株，復(fù)治患者22株。

1.2 實驗材料

改良羅氏培養(yǎng)基：酸性，中性；含有各種抗結(jié)核藥物的改良羅氏培養(yǎng)基[異煙肼(INH)、利福平(RFP)、鏈霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、卡那霉素(KM)、氧氟沙星(OFX)]；2%氫氧化鈉溶液。羅氏培養(yǎng)基和含有各種抗結(jié)核藥物的培養(yǎng)基均由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。H37Rv標準菌株由江西省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實驗室提供。

1.3 實驗方法

采用固體比例法對結(jié)核分枝桿菌菌株進行INH、RFP、SM、EMB、KM、OFX等6種藥物的敏感性試驗，并同時用PNB、TCH進行結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌、人型與牛型結(jié)核桿菌的菌種鑒定。疑似污染的菌株用2%氫氧化鈉處理后轉(zhuǎn)種酸性羅氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間過長的或菌量過少的菌株則轉(zhuǎn)種中性羅氏培養(yǎng)基，待3～4周后再取菌進行藥敏試驗和菌種鑒定。具體檢測步驟及結(jié)果判斷參照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》進行。實驗操作在撫州市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實驗室內(nèi)完成，以H37Rv標準菌株作為實驗對照。

1.4 質(zhì)量控制

實驗人員每年參加江西省疾病預(yù)防控制中心舉辦的業(yè)務(wù)培訓，實驗過程中按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》和《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》做好質(zhì)量控制，所在實驗室每年參加中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實驗室組織的結(jié)核藥敏試驗熟練度測試，成績均合格。

1.5 觀察指標

1)總耐藥率：指對6種藥敏試驗的抗結(jié)核藥物中的任何1種或1種以上的耐藥菌株在全部受試菌株中所占的百分比；2)單耐藥：僅對1種一線抗結(jié)核藥物耐藥；3)多耐藥：對1種以上一線抗結(jié)核藥物耐藥(不包括同時對異煙肼和利福平耐藥)；4)耐多藥(MDR)：至少同時對異煙肼和利福平耐藥；5)廣泛耐藥(XDR)：在耐多藥的基礎(chǔ)上至少同時對1種氟喹諾酮類和1種二線注射類抗結(jié)核藥物耐藥。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用Excel2010和SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病與流行趨勢

2015—2019年共收集528株分枝桿菌，經(jīng)PNB、TCH鑒定為結(jié)核分枝桿菌491株，其中2015年56株，2016年50株，2017年66株，2018年141株，2019年193株；對1種及以上藥物耐藥的菌株共80株，總耐藥率為16.29%，其中2015年總耐藥率最高(21.43%)，2016年最低(12.00%)，各年度總耐藥率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

491株結(jié)核分枝桿菌，來源于男性患者379株，女性患者112株，男女比為3.38:1；男、女總耐藥率分別為15.57%(59/379)、18.75%(21/112)，兩者總耐藥率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.642，P>0.05)。

源自男性初治患者359株，產(chǎn)生耐藥49株(13.65%)；男性復(fù)治患者20株，產(chǎn)生耐藥10株(50.00%)，男性初治與復(fù)治總耐藥率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.046，P<0.001)。源自女性初治患者110株，產(chǎn)生耐藥20株(18.18%)；女性復(fù)治患者2株，產(chǎn)生耐藥1株(50.00%)，女性初治與復(fù)治總耐藥率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.305,P=0.253)。

表1 2015—2019年撫州市涂陽肺結(jié)核臨床

491株結(jié)核分枝桿菌，來源于≥60歲年齡組最多，共215株，占43.79%，且呈現(xiàn)年齡越大結(jié)核分枝桿菌占比越多的特點。0～19歲年齡組只有初治患者，產(chǎn)生耐藥1株，總耐藥率為14.29%(1/7)；20～39歲年齡組產(chǎn)生耐藥16株，總耐藥率為17.20%(16/93)，僅有的2株復(fù)治患者菌株未產(chǎn)生耐藥；40～59歲年齡組產(chǎn)生耐藥32株，總耐藥率為18.18%(31/176)，其中初治患者總耐藥率為16.27%(27/166)，復(fù)治患者總耐藥率為50.00%(5/10)，二者比較差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=7.126，P<0.001)；≥60歲年齡組產(chǎn)生耐藥31株，總耐藥率為14.42%(31/215)，其中初治患者總耐藥率為12.20%(25/205)，復(fù)治患者總耐藥率為60.00%(6/10)，二者比較差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=17.659，P<0.001)。見表2。

表2 不同年齡組結(jié)核分枝桿菌耐藥情況比較

2.2 耐藥率

491株結(jié)核分枝桿菌，耐藥菌株80株，總耐藥率為16.29%。初治患者菌株469株，耐藥菌株69株，總耐藥率為14.71%；復(fù)治患者菌株22株，耐藥菌株11株，總耐藥率為50.00%；初治患者總耐藥率顯著低于復(fù)治患者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.186，P<0.001)。只對一種藥物耐藥菌株48株，耐藥率為9.78%，其中初治患者(9.38%)與復(fù)治患者(18.18%)比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.845，P>0.05)；多耐藥菌株16株，耐藥率為3.26%，其中初治患者(2.35%)顯著低于復(fù)治患者(22.73%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=27.692，P<0.001)；耐多藥菌株16株，耐藥率為3.26%，其中初治患者(2.99%)與復(fù)治患者(9.09%)比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.485，P>0.05)；在耐多藥菌株中，發(fā)現(xiàn)4株為廣泛耐多藥菌株，耐藥率為0.81%(4/491)。見表3。

表3 不同患者結(jié)核分枝桿菌耐藥率比較

2.3 耐藥情況

在所有結(jié)核分枝桿菌菌株中，6種藥物任一耐藥情況由高到低依次為INH、SM、OFX、RFP、EMB、KM；初、復(fù)治患者中耐藥率最高的分別是INH(6.82%)、OFX(31.82%)，最低的均為KM，初、復(fù)治患者菌株在對OFX、RFP、SM、EMB 4種藥物的耐藥率上差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 結(jié)核分枝桿菌耐藥情況比較

2.4 耐藥譜構(gòu)成

2.4.1 單藥耐藥

單耐一種藥物的菌株在所有耐藥菌株中占比60.00%(48/80)，其中單耐一線藥有29株(耐藥率為5.91%)，以單耐SM為最高(2.65%)；單耐二線藥有19株(耐藥率為3.87%)，主要為耐OFX菌株?？傮w上看，單耐一種藥物的耐藥率順位為OFX(3.67%)>SM(2.65%)>INH(2.04%)>RFP(1.22%)>KM(0.20%)>EMB(0%)。在所有單耐一種藥物的菌株中，源自初治患者的為44株，占91.67%，其耐藥率高低排序與總的單藥耐藥排序一致；源自復(fù)治患者的為4株，耐OFX菌株占了一半。見表5。

2.4.2 耐多藥

初治患者菌株中，耐多藥的組合有8種，其中有7種組合為耐一線藥物，耐藥組合分別為：INH+RFP、INH+RFP+SM、INH+RFP+EMB+SM、INH+RFP+EMB+SM+KM+OFX、INH+RFP+SM+OFX、INH+RFP+EMB+SM+OFX、INH+RFP+OFX、INH+RFP+SM+KM+OFX、INH+RFP+KM+OFX；復(fù)治患者菌株耐藥譜組合只有2種，耐藥組合為INH+RFP+SM+OFX、INH+RFP+OFX。見表5。

2.4.3 多耐藥

初治患者多耐藥組合有7種，分別為INH+SM、SM+KM、INH+EMB、INH+OFX、INH+EMB+SM+OFX、RFP+EMB、RFP+KM，以耐INH+SM組合最高(1.07%)；復(fù)治患者多耐藥組合有5種，分別為SM+KM、INH+EMB+OFX、RFP+EMB+OFX、RFP+SM+OFX、RFP+SM，耐藥率均為4.55%。見表5。

表5 結(jié)核分枝桿菌耐藥譜構(gòu)成情況

3 討論

我國是全球30個結(jié)核病高負擔國家之一，位居全球第2位，每年新報告肺結(jié)核患者約80萬例，位居甲乙類傳染病第2位，學校聚集性疫情時有發(fā)生，耐藥問題比較突出，患者醫(yī)療負擔較重，防治任務(wù)十分艱巨[5]。我國結(jié)核病的流行特征為感染人數(shù)多、患病人數(shù)多、死亡人數(shù)多、農(nóng)村患者多、耐藥結(jié)核患者多及疫情居高不下這五多一高的趨勢特點[6]。盡管有統(tǒng)計表明近年來我國結(jié)核病的發(fā)病率呈年遞降勢頭，但2018年我國利福平耐藥結(jié)核病患者約有6.6萬，占全球的14%[7]，且江西省2018年結(jié)核病發(fā)病率仍有70.83/10萬[8]，超過了全國平均水平(59.3/10萬)[9]，結(jié)核病防治工作形勢依然嚴峻。了解結(jié)核病流行狀況是做好結(jié)核病防治工作的前提條件，特別是在耐藥問題比較突出的情況下，結(jié)核病耐藥性監(jiān)測與分析可以為結(jié)核病的防治制定精準、可靠的依據(jù)，因此做好結(jié)核病耐藥性監(jiān)測與分析對結(jié)核病防治工作具有重要作用。

本次調(diào)查顯示，撫州市2015—2019年結(jié)核病總耐藥率(16.29%)低于全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告(2007—2008年)[10]、2014—2017年新余市[11]、2014—2015年綿陽市[12]、2012—2017年南寧市[13]、2013年江西省3個耐藥監(jiān)測點[14]的總耐藥率調(diào)查表明，近年來撫州市加強結(jié)核病防治，全面推行的現(xiàn)代結(jié)核病控制策略(DOTS strategy)及持續(xù)的工作經(jīng)費的投入取得了一定成效。總耐藥中復(fù)治患者的耐藥率顯著高于初治患者，這與結(jié)核病患者治療不規(guī)范，復(fù)治患者長期、反復(fù)用藥有關(guān)，因此在制定適合初治患者個性化方案的同時應(yīng)加強治療的規(guī)范化，提高治療的依從性，以便減少耐藥性的產(chǎn)生。

各年齡組中，以40～59歲患者的總耐藥率為最高，這與潘虹等[11]報道的新余市的結(jié)果不一致，與全國基線調(diào)查結(jié)果一致[10]。2個低年齡組均無耐藥菌株，而40～59歲與≥60歲2個高年齡組中復(fù)治患者與初治患者的耐藥率比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可能跟中老年人免疫力下降、健康意識淡薄、服藥依從性差等有關(guān)，也有文獻[10]報道45～64歲是發(fā)生耐多藥結(jié)核病的危險因素。此外，源自2個高年齡組的菌株在所有標本中占比達到了79.63%，這也提示了撫州市要注重加強中老年人結(jié)核病，特別是耐藥結(jié)核病的防治工作。

在單一藥物耐藥中，一線藥物的單耐藥順位為SM(2.65%)>INH(2.04%)>RFP(1.22%)>EMB(0%)，與全國[10]、南寧市[13]、陜西省[15]的調(diào)查結(jié)果及大連市2000年前的情況[16]一致。二線藥物的單一耐藥是耐OFX(3.67%)高于耐KM(0.2%)，也與上述報道[10,13,15-16]一致，可能與以O(shè)FX為代表的氟喹諾酮類藥物在其他感染的廣泛使用及二線抗結(jié)核藥物的不規(guī)范使用有關(guān)[15]。特別是從總體上來看，撫州市OFX的耐藥率為6種抗結(jié)核藥物耐藥率之首，這與上述報道[10,13,15-16]均不一致，更反映出本地區(qū)氟喹諾酮類藥物耐藥的嚴重性。在耐藥組合上，多耐藥以耐INH+SM為最高，這與許多報道[10,13-16]一致，耐多藥中則以耐INH+RFP和耐INH+RFP+SM相對更高些。

本次調(diào)查顯示，撫州市2015—2019年度結(jié)核病多耐藥率和耐多藥率均為3.26%，兩者明顯低于2007—2008年全國(8.36%，8.32%)[10]、2007年江西省部分地區(qū)(7.69%，8.39%)[17]和2014—2017年同省份的新余市(4.09%，9.75%)[11]的調(diào)查結(jié)果，略低于2013年江西省3個耐藥監(jiān)測點(3.53%，3.89%)[14]的調(diào)查結(jié)果；但0.81%廣泛耐多藥率的調(diào)查結(jié)果，雖低于江西部分地區(qū)的16.67%[17]，卻高于全國0.68%[10]的調(diào)查結(jié)果，接近于江西省3個耐藥監(jiān)測點0.42%[14]調(diào)查結(jié)果的2倍。雖不排除本研究結(jié)果與樣本量少、代表性低有關(guān)，但較高的廣泛耐多藥率反映了撫州市結(jié)核病防治工作的嚴峻性，應(yīng)予以高度重視。撫州市耐RFP率為5.50%，據(jù)報道[18]在耐RFP的菌株中有95%的同時耐INH，而本調(diào)查中耐RFP菌株中只有16株同時耐INH，僅占59.26%(16/27)，明顯低于世界衛(wèi)生組織[1]報道的78%和張?zhí)烊A等[18]報道的76.3%的結(jié)果，也低于楊建等[15]報道的66.32%和蔡春葵等[16]報道的66.9%，其原因需要進一步研究。

在總共收集到的528株標本中，非結(jié)核分枝桿菌數(shù)、牛結(jié)核分枝桿菌有29株(5.49%)，無結(jié)果8株(1.52%)，其原因除實驗本身外，可能也與撫州市結(jié)核分子診斷技術(shù)使用率不高，降低了對非結(jié)核的排除、部分送檢標本質(zhì)量不好等有關(guān)。為此，應(yīng)加強實驗人員的技術(shù)培訓和質(zhì)量控制，積極提高分子檢測技術(shù)使用率，以不斷提高結(jié)核分枝桿菌的檢出率和耐藥結(jié)核病的發(fā)現(xiàn)率。

耐藥率是評價結(jié)核病防治工作成效的一項重要指標，初始耐藥水平的高低關(guān)乎著結(jié)核病控制規(guī)劃實施成效的好壞。目前撫州市正在開展的現(xiàn)代結(jié)核病控制策略(DOTS strategy)，在提高結(jié)核病患者的治愈率和降低耐藥率上取得了一定成績，但也存在著復(fù)治患者特別是中老年患者耐藥率高，廣泛耐多藥率相對較高、分子診斷技術(shù)使用率低等問題。結(jié)核病是一個對個體健康、社會生活高危害的病種，特別是耐藥結(jié)核病危害更大，因此有必要持續(xù)高度重視該疾病的防治，并積極調(diào)整策略，以確保防治工作取得更大進步。