錢曉婷 呂夢(mèng)迪 王 裙 陶 欽 薛旭玲 劉紅科

(南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，南京 210023)

癌癥作為全球人類死亡的第二大殺手，給人們的生命健康帶來(lái)了極大的威脅。作為臨床常用的金屬化療藥物，鉑類藥物具有較好的藥理學(xué)特性，對(duì)多種實(shí)體瘤都具有很好的治療效果[1-2]，但是這類金屬藥物的腎毒性及耐藥性等問(wèn)題極大地限制了其藥效發(fā)揮[3-4]。因此，科學(xué)家們逐漸把目標(biāo)轉(zhuǎn)向其他類金屬(如釕、銥、鋨及銠等)抗癌配合物[5-8]，這類抗癌配合物與鉑類藥物相比具有低毒性、無(wú)耐藥性及豐富的光學(xué)性質(zhì)等優(yōu)良特性。Keppler等報(bào)道的KP1019是進(jìn)入Ⅰ期試驗(yàn)的釕類配合物，研究表明該配合物具有較好的穩(wěn)定性，且對(duì)順鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞也表現(xiàn)出良好的細(xì)胞毒性[9]。Sadler課題組報(bào)道了一系列具有生物活性的釕類配合物，發(fā)現(xiàn)這些釕類配合物具有較小的毒副作用、高的細(xì)胞攝取量及生物靶點(diǎn)豐富等優(yōu)良特性，表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景[10-12]。本課題組也通過(guò)將金屬釕與天然產(chǎn)物甘草次酸、紫蘇醇及大黃酸等相連接，設(shè)計(jì)得到了一系列具有良好抗腫瘤活性的釕配合物[13-14,17]。其中聯(lián)吡啶釕類配合物因其大的斯托克斯位移、較長(zhǎng)的發(fā)光壽命、很高的反應(yīng)活性以及氧化還原等特性，使其成為潛在的診療一體化的藥物應(yīng)用于生物體內(nèi)[15-17]。一些聯(lián)吡啶釕類藥物還可以做到可控藥物釋放和不同光激發(fā)下的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)藥物輸送過(guò)程[18-19]。

吲哚類化合物在自然界中廣泛存在，是具有苯并五元氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)單元的一大類化合物。該類化合物是一類重要的雜環(huán)衍生物生物堿，在生物體內(nèi)顯現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性[20-23]。靛玉紅、長(zhǎng)春堿等吲哚類化合物對(duì)慢粒白血病、絨毛膜上皮癌、乳腺癌及宮頸癌等都具有較好的療效，因而受到廣泛關(guān)注[24-26]。Sugen公司于2006年上市的舒尼替尼是一種多靶點(diǎn)抑制劑，主要用于治療惡性間質(zhì)瘤[27]。這類小分子均通過(guò)抑制微管蛋白的合成來(lái)影響有絲分裂過(guò)程，從而達(dá)到抗腫瘤的目的[28-29]。同時(shí)還有一些吲哚類的小分子具有抑制腫瘤細(xì)胞中2，3-雙加氧酶生成的作用，2，3-雙加氧酶的過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致色氨酸的代謝或不足，而導(dǎo)致T細(xì)胞的無(wú)效性，抑制其生成可以達(dá)到免疫治療的功效[30]。因此，吲哚類小分子化合物在抗癌領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步探究。

在本工作中，我們合成了一種基于吲哚類衍生物的二聯(lián)吡啶釕配合物，并對(duì)其進(jìn)行了核磁及質(zhì)譜的表征。使用MTT法對(duì)配合物的細(xì)胞毒活性進(jìn)行了評(píng)估，通過(guò)共聚焦成像、電感耦合等離子體質(zhì)譜確定了配合物的亞細(xì)胞器定位，同時(shí)使用流式細(xì)胞術(shù)及免疫蛋白印跡等手段對(duì)配合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的方式等進(jìn)行了深入研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用的試劑及化學(xué)藥品均為商用分析純，無(wú)需進(jìn)一步純化即可直接使用。水合氯化釕(RuCl3·3H2O)、3-吡啶乙酸鹽酸鹽 (3-pyridylacetic acid hydrochloride)、1H-吲哚-3-甲醛(1H-indole-3-carbaldehyde)、2，2′-聯(lián)吡啶(2，2′-bipyridine)、氯化鋰(lithium chloride)等化學(xué)藥品購(gòu)于晚晴化學(xué)品公司。六氫吡啶、二甲基亞砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等試劑均購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司。牛血清白蛋白(BSA)、Dulbecco改良的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)、鏈霉素和青霉素、胰蛋白消化酶-EDTA、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞自噬檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒等生物試劑均購(gòu)于南京凱基生物科技有限公司。

1H NMR使用Bruker Avance Ⅱ 400 MHz波譜儀檢測(cè)；電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)使用LCQ(Thermo Scientific)質(zhì)譜儀檢測(cè)；UV-Vis數(shù)據(jù)使用Lambda 365紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得；熒光數(shù)據(jù)使用FS5熒光分光光度計(jì)(Edinburgh Instrument)獲得；化合物的細(xì)胞毒活性通過(guò)多功能酶標(biāo)儀LabServ K3測(cè)定；激光共聚集顯微鏡(A1，Nikon)測(cè)試配合物在細(xì)胞內(nèi)的共定位成像；應(yīng)用流式細(xì)胞儀(BD FACSverse，美國(guó))進(jìn)行細(xì)胞凋亡、周期及自噬等分析測(cè)定；采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，X Series 2，Thermo Fisher)測(cè)定金屬元素Ru在細(xì)胞器內(nèi)的含量；在Mini-Protean Tetra System(BIO RAD，Power PacTM HC)上進(jìn)行蛋白免疫印跡(Western Blot)實(shí)驗(yàn)。

1.2 配體及配合物的合成

1.2.1 3-(2-吡啶-3-乙烯基)-1H-吲哚配體Indole的合成

將 3-吡啶乙酸鹽酸鹽(0.52 g，3 mmol)溶解在1，4-二氧六環(huán)(6 mL)中，并加入三乙胺(1 070 μL，7.6 mmol)，將混合溶液在環(huán)境溫度下避光攪拌20 min，隨后加入 1H-吲哚-3-甲醛(0.292 g，2.0 mmol)和六氫吡啶(440 μL)，并將上述混合液在氬氣氣氛下避光室溫?cái)嚢?0 h，使用薄層色譜法(TLC)監(jiān)測(cè)至反應(yīng)結(jié)束后旋干溶劑。將所得粗產(chǎn)物通過(guò)快速柱色譜法(石油醚/乙酸乙酯，4∶1，V/V)分離提純，得到淺黃色固體(0.308 g，70%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ11.40(s，1H)，8.76(d，J=2.0 Hz，1H)，8.37(dd，J=4.7，1.5 Hz，1H)，8.02(ddd，J=8.0，7.1，4.7 Hz，2H)，7.69(d，J=2.6 Hz,1H),7.58(s,1H)，7.54(s,1H)，7.43(t，J=9.2 Hz，1H)，7.36(dd，J=7.9，4.7 Hz，1H)，7.25～7.04(m，3H)。ESI-MS(m/z)：[Indole+H]+理論值：220.28，實(shí)驗(yàn)值：220.15。元素分析按 C15H12N2計(jì)算值(%)：C 81.79，H 5.49，N 12.72。實(shí)驗(yàn)值(%)：C 81.87，H 5.51，N 12.65。

1.2.2 二聯(lián)吡啶釕前體Ru(bpy)2Cl2的合成

將 RuCl3·3H2O(3.6 g，14.9 mmol)、2，2′-聯(lián)吡啶(4.68 g，30 mmol)、LiCl(4.2 g，1 mmol)和 DMF(25 mL)加入到避光的三口燒瓶中，將混合物在氬氣氛圍下加熱回流攪拌10 h，TCL監(jiān)測(cè)至反應(yīng)結(jié)束后旋干溶劑。待冷卻至室溫后，將反應(yīng)液倒入丙酮(125 mL)中，在0℃下冷卻過(guò)夜。過(guò)濾該混合物，分別用水(15 mL×3)、乙醇(15 mL×3)和乙醚(15 mL×3)依次洗滌固體，然后將固體放入真空烘箱中干燥過(guò)夜，得到棕黑色粉末即為純的產(chǎn)品(4.7 g，78%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ9.97(d，J=4.7 Hz，1H)，8.65(d，J=8.0 Hz，1H)，8.50(d，J=8.0 Hz，1H)，8.14～8.02(m，1H)，7.78(dd，J=9.6，3.6 Hz，1H)，7.73～7.64(m，1H)，7.52(d，J=5.5 Hz，1H)，7.19～7.04(m，1H)。ESI-MS(m/z)：[Ru(bpy)2]2+理論值：206.67，實(shí)驗(yàn)值：206.58。

1.2.3 配合物Ru-Indole的合成

將前體 Ru(bpy)2Cl2(96 mg，0.18 mmol)、配 體Indole(44 mg，0.2 mmol)、10 mL乙醇-水的混合溶劑(8∶2，V/V)加入到三口燒瓶中，并將混合物在氬氣氛圍下回流24 h，TLC監(jiān)測(cè)至反應(yīng)結(jié)束后旋干溶劑。加入三氯甲烷(2 mL)溶解固體，再加入乙醚(15 mL)將配合物沉淀出來(lái)，將混合物在0℃冷卻過(guò)夜。離心得到固體后，用乙醚(10 mL×2)和丙酮(10 mL×2)洗滌，真空干燥過(guò)夜，得到95.1 mg較純的深紅色固體，即為產(chǎn)品Ru-Indole，產(chǎn)率約為75%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ11.50(s，1H)，9.91(t，J=22.0 Hz，1H)，8.79(t，J=11.1 Hz，1H)，8.71～8.64(m，1H)，8.60(dd，J=10.0，7.2 Hz，1H)，8.25～8.12(m，1H)，8.06(d，J=8.0 Hz，1H)，7.93(dd，J=9.1，5.2 Hz，2H)，7.81～7.74(m，1H)，7.71(s，1H)，7.63(d，J=5.3 Hz，1H)，7.42(dd，J=15.6，7.2 Hz，1H)，7.30(dd，J=12.9，6.7 Hz，1H)，7.16(dt，J=15.0，6.7 Hz，1H)，6.92(d，J=16.6 Hz，1H)。ESIMS(m/z)：[Ru-Indole-Cl]+理論值：669.17，實(shí)驗(yàn)值：669.11。元素分析按C35H28ClF6N6PRu計(jì)算值(%)：C 51.64，H 3.47，N 10.32。實(shí)驗(yàn)值(%)：C 51.73，H 3.55，N 10.27。

1.3 配體及配合物的光物理性質(zhì)測(cè)定

使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)了配體Indole及配合物Ru-Indole在298 K下的紫外吸收光譜。用DMSO將配合物及配體溶解并制成20 mmol·L-1的儲(chǔ)存液，用水將兩者的儲(chǔ)存液分別稀釋成30 μmol·L-1的含有1% DMSO的樣品溶液。測(cè)試時(shí)石英比色皿與光源路徑為1 cm，吸收波長(zhǎng)收集范圍設(shè)定為250～600 nm。使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)配合物及配體在298 K下的熒光發(fā)射光譜。用水將兩者的儲(chǔ)存液分別稀釋成10 μmol·L-1的含有1% DMSO的樣品溶液，并在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下使用熒光分光光度計(jì)記錄下550～700 nm范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。

1.4 配體及配合物的脂水分配系數(shù)

使用搖瓶法測(cè)試Indole、Ru(bpy)2Cl2及配合物Ru-Indole的脂水分配系數(shù)。使用正辛醇與0.9% NaCl溶液等體積搖動(dòng)48 h使水相與有機(jī)相互飽和。將三者分別溶解在分離出的NaCl溶液中，再加入等體積的分離出的正辛醇溶液，在室溫下?lián)u動(dòng)2 h，使樣品在兩相中達(dá)到分配平衡。用7 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速將樣品離心5 min，分別吸出有機(jī)相及水相，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)試兩相中的吸光度，通過(guò)在有機(jī)相及水相中的吸光度的比值求對(duì)數(shù)計(jì)算出脂水分配系數(shù)lgPo/w值。

1.5 體外細(xì)胞毒活性檢測(cè)

選用人源腫瘤細(xì)胞系宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、肝癌細(xì)胞(HepG2)及人正常肝細(xì)胞(LO2)，對(duì)配體Indole、配合物前體Ru(bpy)2Cl2、配合物Ru-Indole以及對(duì)照藥物順鉑(cisplatin)采用 MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)法[31]進(jìn)行細(xì)胞毒活性測(cè)定。細(xì)胞在含有10% FBS(胎牛血清，Gibco BRL)、100 μg·mL-1鏈霉素和100 μg·mL-1青霉素(Gibco BRL)的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，Gibco BRL)中培養(yǎng)。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種(每孔5 000個(gè))對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞在5%(體積分?jǐn)?shù),下同)的CO2、310 K條件下培養(yǎng)過(guò)夜以確保細(xì)胞貼壁且正常生長(zhǎng),加入不同濃度的待測(cè)藥物(培養(yǎng)基中含1%的DMSO溶液)繼續(xù)孵育48 h。然后每孔加入20 μL的濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸出培養(yǎng)液，在每個(gè)孔中加入150 μL的二甲亞砜溶液，振蕩5 min后，使用LabServ K3酶標(biāo)儀讀取590 nm處吸光度值，計(jì)算各物質(zhì)對(duì)癌細(xì)胞在48 h內(nèi)增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50值)[32]。

1.6 配合物的亞細(xì)胞器分布

激光共聚焦成像實(shí)驗(yàn)：分別使用探針Mito-green、Lyso-blue、Hoechst 33342檢測(cè)Ru-Indole在HeLa細(xì)胞中線粒體、溶酶體和細(xì)胞核中的分布。將HeLa細(xì)胞以5×105mL-1的密度接種于12孔板中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。然后向其中加入含20 μmol·L-1待測(cè)藥物的DMEM培養(yǎng)基(含有1% DMSO)溶液，繼續(xù)孵育12 h。吸出培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，將濃度為2 μmol·L-1的線粒體、溶酶體及細(xì)胞核染料分別加入對(duì)應(yīng)的孔中，孵育30 min后吸出染料，并用PBS洗滌3次，取出蓋玻片并倒扣在載玻片上，在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行測(cè)試。商業(yè)染料為Mito-green(λex=490 nm，λem=516 nm)、Lyso-blue(λex=373 nm，λem=425 nm)、Hoechst 33342(λex=346 nm，λem=460 nm)。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)：將HeLa細(xì)胞以2×106mL-1的密度接種在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并將細(xì)胞在5% CO2、310 K條件下孵育12 h。然后將含20 μmol·L-1Ru-Indole的DMEM培養(yǎng)基(含有1% DMSO)溶液添加到細(xì)胞中，繼續(xù)孵育12 h，收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次。然后用線粒體/細(xì)胞核制備試劑分別提取細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)。分別向提取到的細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中依次添加濃硝酸(100 μL，95 ℃，2 h)、30%過(guò)氧化氫(50 μL，95 ℃，1.5 h)和濃鹽酸(50 μL，95 ℃，0.5 h)，將細(xì)胞器完全消解。待溶液冷卻至室溫后，將消化得到的液體過(guò)濾并用超純水稀釋至2 mL。樣品中釕元素的含量通過(guò)ICPMS(X系列2，Thermo Fisher，美國(guó))測(cè)定。每個(gè)樣品測(cè)試3次，將平均值作為最終結(jié)果。

1.7 細(xì)胞周期阻滯檢測(cè)

使用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(RNase A/PI)研究Ru-Indole對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響。將HeLa細(xì)胞以1.5×106mL-1的密度接種于6孔板中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。然后向其中加入含有不同濃度梯度(0、10、20、40 μmol·L-1)的配合物的DMEM培養(yǎng)基(含有1% DMSO)溶液，繼續(xù)孵育24 h。收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，緩慢加入體積分?jǐn)?shù)為70%的冰乙醇來(lái)重懸細(xì)胞，并置于4℃的冰箱中過(guò)夜固定。離心除去固定液收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，然后將根據(jù)一定比例(PI/RNase A，9∶1，V/V)配制的染色液加入到細(xì)胞中并在黑暗條件下孵育30 min。在30 min內(nèi)使用BD FACSverse流式細(xì)胞儀分析樣品，選擇的通道為FL2(λex=488 nm，λem=620 nm)，使用FlowJo10.1軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒探究Ru-Indole誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的死亡方式。將HeLa細(xì)胞以1.5×106mL-1的密度接種于6孔板中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。然后向其中加入含有不同濃度梯度(0、10、20、40 μmol·L-1)的Ru-Indole的DMEM培養(yǎng)基(含有 1% DMSO)溶液繼續(xù)孵育24 h。收集細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，并用500 μL的Binding buffer重懸細(xì)胞。每個(gè)孔中分別加入5 μL的V-FITC和5 μL的PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)20 min的避光染色處理，0.5 h內(nèi)使用BD FACSverse流式細(xì)胞儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。PI的激發(fā)波長(zhǎng)：488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：550～610 nm；FITC的激發(fā)波長(zhǎng)：488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：500～560 nm。

1.9 線粒體膜電位(MMP)的檢測(cè)

使用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒JC-1檢測(cè)Ru-Indole處理的HeLa細(xì)胞MMP的變化。將HeLa細(xì)胞以1.5×106mL-1的密度接種于6孔板中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。然后向其中加入含有不同濃度梯度(0、10、20、40 μmol·L-1)的配合物的 DMEM 培養(yǎng)基 (含有 1% DMSO)溶液繼續(xù)孵育24 h。收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，并添加到配制的JC-1工作溶液中染色25 min。離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，之后將細(xì)胞重懸于PBS緩沖液中。0.5 h內(nèi)使用BD FACSverse流式細(xì)胞儀分析樣品，選擇的通道為FL1(λex=488 nm，λem=510～550 nm)和 FL2(λex=525 nm，λem=560～620 nm)，最后使用FlowJo10.1軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

1.10 細(xì)胞自噬分析

激光共聚焦成像實(shí)驗(yàn)：使用細(xì)胞自噬檢測(cè)試劑盒對(duì)配合物Ru-Indole誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬的細(xì)胞群進(jìn)行熒光成像分析。將HeLa細(xì)胞以5×105mL-1的密度接種于12孔板中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。然后向其中加入含20 μmol·L-1待測(cè)藥物的 DMEM 培養(yǎng)基(含有 1% DMSO)溶液，繼續(xù)孵育24 h。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入3.7%甲醛固定，并在室溫下孵育20 min，除去溶液，用PBS洗滌2次后向12孔板中加入0.2% Triton X-100滲透液共孵育15 min后去除，加入一抗LC3兔多抗工作液，在黑暗條件下室溫孵育2 h，然后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次。再加入FITC標(biāo)記的山羊兔抗IgG的二抗在黑暗中繼續(xù)孵育1 h，用PBS洗滌細(xì)胞3次。然后加入DAPI工作液孵育3～5 min來(lái)染色細(xì)胞核，用PBS洗滌細(xì)胞2次，立即使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝。DAPI的激發(fā)波長(zhǎng)：357 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：430～490 nm；FITC的激發(fā)波長(zhǎng)：488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：500～560 nm。

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)：將HeLa細(xì)胞以2×106m L-1的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，在5% CO2、310 K條件下孵育12 h以確保細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。然后向其中加入含有不同濃度梯度(0、10、20、40 μmol·L-1)的Ru-Indole的DMEM培養(yǎng)基(含有1% DMSO)溶液繼續(xù)孵育24 h。之后，通過(guò)離心收集全細(xì)胞，使用RIPA細(xì)胞裂解試劑盒在0℃條件下提取全細(xì)胞裂解液和蛋白，并用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。將不同濃度配合物處理過(guò)的蛋白樣品進(jìn)行歸一化處理，向歸一化的樣品中加入SDSPAGE上樣緩沖液(1×)，隨后將蛋白樣品在95℃條件下加熱15 min。冷卻至室溫后，蛋白質(zhì)樣品在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE，12%分離凝膠和15%濃縮凝膠)上電泳，然后在電流(200 mA，1 h)和冰浴條件下，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。膜轉(zhuǎn)移后，用脫脂奶粉(溶于5% PBST，即含吐溫-20的PBS緩沖液)密封蛋白2 h，然后選用合適的一抗將其稀釋至特定的濃度，將膜在一抗中孵育過(guò)夜使其與特異性蛋白結(jié)合。結(jié)束后，使用PBST緩沖液進(jìn)行洗滌(5×8 min)。將洗凈的膜置于預(yù)先配制好的二抗孵育液中孵育1 h，再使用PBST緩沖液進(jìn)行洗滌(5×8 min)。將等體積配制好的ECL顯影液覆蓋在PVDF膜上，孵育2 min后使用Power PacTM HC(新加坡)的BIO RAD成像，通過(guò)Image Lab軟件分析圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成與表征

選取具有抗腫瘤活性的3-吲哚甲醛[33-34]，將其與3-吡啶乙酸鹽酸鹽通過(guò)羥醛縮合反應(yīng)進(jìn)行化學(xué)修飾得到配體3-(2-吡啶-3-乙烯基)-1H-吲哚(Indole)；二聯(lián)吡啶釕前體Ru(bpy)2Cl2的合成參考文獻(xiàn)通過(guò)將RuCl3·3H2O與2，2′-聯(lián)吡啶在DMF中通過(guò)配位成鍵得到[35]；繼續(xù)將Indole與Ru(bpy)2Cl2在乙醇和水的體系中加熱回流重結(jié)晶提純，即可通過(guò)氮原子與釕原子進(jìn)行配位成鍵的方式得到具有抗腫瘤活性的配合物Ru-Indole。合成路徑如圖1所示。通 過(guò)1H NMR及 ESI-MS對(duì) 配 體 Indole、前 體Ru(bpy)2Cl2及配合物Ru-Indole進(jìn)行了表征。

圖1 配體Indole及配合物Ru-Indole的合成路線Fig.1 Synthetic routes of ligand Indole and complex Ru-Indole

2.2 配體及配合物的光物理性質(zhì)

研究金屬配合物的光物理性質(zhì)有望實(shí)現(xiàn)配合物在細(xì)胞內(nèi)的可視化跟蹤進(jìn)而探究其對(duì)細(xì)胞的生理學(xué)功能[36-37]。我們使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)及熒光分光光度計(jì)測(cè)試了配體Indole及配合物Ru-Indole的紫外吸收及熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如圖2所示。圖2A為配體的紫外吸收及熒光發(fā)射譜圖，配體的紫外吸收波長(zhǎng)為320 nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為490 nm。圖2B為配合物的紫外吸收及熒光發(fā)射譜圖。從圖中可以看出Ru-Indole的吸收帶范圍為260～550 nm，其中295 nm處的吸收帶歸屬于Ru-Indole分子中自旋允許的聯(lián)吡啶N^N為中心(1LC)的π-π*躍遷，在330 nm處的吸收帶歸屬于金屬到配體的電荷轉(zhuǎn)移(1MLCT及3MLCT)及配體到配體的電荷轉(zhuǎn)移(LLCT)[38]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)配合物Ru-Indole在用450 nm的光激發(fā)時(shí)，在590 nm處有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。這與無(wú)熒光發(fā)射的釕類配合物相比有望實(shí)現(xiàn)配合物在細(xì)胞內(nèi)的可視化跟蹤成像。

圖2 配體Indole(A)及配合物Ru-Indole(B)在水溶液中的紫外吸收及熒光發(fā)射譜圖Fig.2 UV absorption and fluorescence emission spectra of ligand Indole(A)and complex Ru-Indole(B)in aqueous solution

2.3 配合物的脂水分配系數(shù)

化合物的親脂性是衡量細(xì)胞攝取量的重要指標(biāo)[39]，研究表明，親脂性較強(qiáng)的物質(zhì)更易透過(guò)細(xì)胞膜的磷脂雙分子層而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而更有利于其發(fā)揮藥效[40]。反之，親水性較強(qiáng)的化合物，則不易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。我們使用搖瓶法對(duì)配合物、配體及前體的脂溶性進(jìn)行了測(cè)試，并用lgPo/w說(shuō)明化合物的親脂性能。lgPo/w值是物質(zhì)在正辛烷(油)和水中的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值，能反映物質(zhì)在油水兩相中的分配情況。lgPo/w值越大，說(shuō)明該物質(zhì)親脂性越強(qiáng)；反之，lgPo/w值越小，則親水性越強(qiáng)[41]。結(jié)果如表1所示。該結(jié)果表明引入的配體有效地增強(qiáng)了配合物的脂溶性，從而使配合物更容易進(jìn)入細(xì)胞；而前體Ru(bpy)2Cl2具有較小的lgPo/w值，說(shuō)明其透過(guò)細(xì)胞膜的能力不如配合物Ru-Indole。

表1 配合物Ru-Indole、前體Ru(bpy)2Cl2及配體Indole的脂溶性數(shù)值Table 1 Lipid solubility values of complex Ru-Indole,precursor Ru(bpy)2Cl2 and ligand Indole

2.4 細(xì)胞毒活性研究

采用MTT法測(cè)定了配體Indole、前體Ru(bpy)2Cl2及配合物Ru-Indole對(duì)宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、肝癌細(xì)胞(HepG2)及人正常肝細(xì)胞(LO2)在48 h的細(xì)胞毒性，并以順鉑cisplatin作為對(duì)照。由配合物IC50值結(jié)果(表2)可以看出，配體Indole及前體Ru(bpy)2Cl2對(duì)腫瘤細(xì)胞幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，其中Indole對(duì)幾種細(xì)胞的 IC50值均大于 100 μmol·L-1，Ru(bpy)2Cl2的IC50值均大于 200 μmol·L-1，這是因?yàn)?Ru(bpy)2Cl2的細(xì)胞攝取量較低，并且可能與細(xì)胞外的分子發(fā)生反應(yīng)[42-43]。而當(dāng)兩者配位后得到的配合物Ru-Indole對(duì)幾種細(xì)胞有5倍甚至10倍毒性的提高，對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性最好，IC50值為20.2 μmol·L-1。此結(jié)果有望為新型抗腫瘤金屬藥物的開(kāi)發(fā)提供設(shè)計(jì)思路[44]。為了探究配合物對(duì)幾種腫瘤細(xì)胞毒性提高的原因，我們對(duì)配合物Ru-Indole在細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

表2 配體Indole、Ru(bpy)2Cl2及配合物Ru-Indole在48 h后對(duì)不同類型細(xì)胞株的IC50值Table 2 IC50 values towards different cells after treated with Ru(bpy)2C l2,Indole,and Ru-Indole for 48 h

2.5 配合物的亞細(xì)胞器分布

了解藥物的細(xì)胞器富集情況有助于進(jìn)一步研究其抗腫瘤活性的作用機(jī)理[45]，探討藥物的細(xì)胞定位常用的方法有激光共聚焦成像法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法等[46]。配合物Ru-Indole具有良好的光物理性質(zhì)，在一定波長(zhǎng)的光激發(fā)下可以產(chǎn)生熒光，因此我們首先通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡研究了Ru-Indole在HeLa細(xì)胞中的亞細(xì)胞器分布情況。如圖3所示，配合物孵育細(xì)胞6 h后，細(xì)胞內(nèi)就有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，說(shuō)明Ru-Indole具有良好的細(xì)胞膜通透性。當(dāng)Ru-Indole的熒光信號(hào)分別與3種商用染料Mito-green、Lyso-blue及Hoechst 33342共孵育時(shí)，可以看出，Ru-Indole的紅色熒光信號(hào)與Mitogreen和Lyso-blue的熒光信號(hào)均具有較好的重疊，這說(shuō)明Ru-Indole可以分布在線粒體和溶酶體中。為了進(jìn)一步確定配合物在亞細(xì)胞器中的分布情況，我們又提取了Ru-Indole孵育12 h后HeLa細(xì)胞的細(xì)胞器，利用ICP-MS檢測(cè)了細(xì)胞器如細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中釕元素的相對(duì)含量，結(jié)果如表3所示。發(fā)現(xiàn)Ru在細(xì)胞質(zhì)中的含量達(dá)52%(含溶酶體)，同時(shí)在線粒體中的含量達(dá)29%，這一結(jié)果與激光共聚焦成像的結(jié)果一致，證明配合物Ru-Indole在溶酶體和線粒體中均有富集，而在細(xì)胞核中富集量很少，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是一致的[47]，同時(shí)為我們進(jìn)一步推斷配合物的抗腫瘤活性作用機(jī)理提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖3 共聚焦顯微鏡測(cè)試配合物Ru-Indole在各細(xì)胞器中的定位圖Fig.3 Confocal microscopy images of HeLa cells treated with Ru-Indole in different organelles

表3 ICP-MS測(cè)試配合物Ru-Indole在亞細(xì)胞器中的分布Table 3 Distribution of complex Ru-Indole in subcellular organelles using ICP-MS technique

2.6 配合物誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞周期阻滯和凋亡

細(xì)胞周期分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)。細(xì)胞周期與細(xì)胞的增殖有直接的關(guān)系[48]，有報(bào)道表明，通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控并將細(xì)胞周期阻滯在特定的分裂期可能是金屬抗癌藥物抑制癌細(xì)胞增殖的原因之一[49-50]。為了研究Ru-Indole對(duì)細(xì)胞周期的影響，我們使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了不同濃度Ru-Indole對(duì)HeLa細(xì)胞的周期阻滯效果，結(jié)果如圖4A所示。與對(duì)照組相比，當(dāng)將不同濃度梯度的Ru-Indole孵育HeLa細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，配合物誘導(dǎo)的G2/M期的細(xì)胞比例呈上升趨勢(shì)，但上升趨勢(shì)不明顯。當(dāng)配合物濃度達(dá)到2倍IC50時(shí)，G2/M期細(xì)胞含量?jī)H從22.9%上升至30.0%，配合物Ru-Indole不能明顯阻滯細(xì)胞周期，這說(shuō)明Ru-Indole不是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生阻滯從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞基因控制的程序性死亡，一些金屬藥物通過(guò)該路徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡從而發(fā)揮細(xì)胞毒性[51-52]。我們使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了配合物Ru-Indole誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及壞死情況，結(jié)果如圖4B所示。經(jīng)不同濃度梯度(0、10、20、40 μmol·L-1)的Ru-Indole處理24 h后，HeLa細(xì)胞的凋亡數(shù)目很少且保持不變，當(dāng)配合物濃度為2倍IC50時(shí)，配合物活細(xì)胞的比例依然高達(dá)90.0%。因此，配合物Ru-Indole誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的途徑不是凋亡而是其他途徑。

圖4 (A)配合物Ru-Indole對(duì)HeLa細(xì)胞周期阻滯效果;(B)配合物Ru-Indole誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡圖Fig.4 (A)Effect of complex Ru-Indole on HeLa cell cycle arrest;(B)HeLa cell apoptosis induced by complex Ru-Indole

2.7 配合物誘導(dǎo)線粒體膜電位變化

從上述結(jié)果中得知配合物Ru-Indole不是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞死亡的，因此我們需要從其他方面來(lái)進(jìn)一步探討Ru-Indole對(duì)細(xì)胞的影響。從藥物攝取結(jié)果了解到Ru-Indole有部分可定位于線粒體，因此我們猜測(cè)它可能對(duì)于線粒體造成損傷從而達(dá)到誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的目的。JC-1是檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化常用的檢測(cè)試劑盒，當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1以聚集體形式存在，同時(shí)發(fā)出紅色熒光(red)，而當(dāng)線粒體膜電位下降時(shí)，JC-1會(huì)以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光(green)，因此JC-1在2個(gè)通道熒光強(qiáng)度的變化經(jīng)常被用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化情況[53]。從圖5的結(jié)果可以看出，當(dāng)我們用不同濃度的 Ru-Indole(0、10、20、40 μmol·L-1)處理 HeLa細(xì)胞時(shí),未經(jīng)藥物處理(0 μmol·L-1)的細(xì)胞的JC-1熒光主要為紅色熒光，而隨著配合物濃度的增加，綠色熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)濃度依賴性增強(qiáng)，同時(shí)紅色熒光強(qiáng)度與綠色熒光強(qiáng)度的比值也隨著配合物濃度的增加逐漸減小，當(dāng)Ru-Indole的濃度達(dá)到 40 μmol·L-1時(shí)，綠色熒光群的比例從 0 μmol·L-1的13.8%增加到42.1%。這表明配合物Ru-Indole具有誘導(dǎo)線粒體膜電位降低的功效，藥物通過(guò)線粒體通路作用是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的原因之一[54]。

圖5 配合物Ru-Indole對(duì)HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的影響:(A)流式細(xì)胞術(shù)用于檢測(cè)線粒體膜電位變化情況;(B)線粒體膜電位降低柱狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.5 Effect of Ru-Indole on mitochondrial membrane potential of HeLa cell:(A)Changes in mitochondrial membrane potential detected by flow cytometry;(B)mitochondrial membrane potential reduction histogram

2.8 配合物誘導(dǎo)細(xì)胞自噬

細(xì)胞死亡方式包含多種途徑：自噬、凋亡、壞死及鐵死亡等[55-57]，其中細(xì)胞自噬為常發(fā)生的細(xì)胞死亡方式。自噬是亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化并經(jīng)溶酶體介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過(guò)程[58]。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞自噬時(shí)，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ含量比值(wⅡ/wⅠ)的大小可評(píng)估自噬水平的高低[59]。前述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞不是通過(guò)凋亡方式發(fā)生死亡的，因此我們進(jìn)一步通過(guò)共聚焦成像和蛋白免疫印跡法研究了細(xì)胞自噬的情況。我們首先使用激光共聚焦顯微鏡探究了配合物Ru-Indole誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬的情況，結(jié)果如圖6A所示。與不加藥物的對(duì)照組相比，加藥組(20 μmol·L-1)處理后的細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度有了明顯的提高，意味著細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了大量的自噬小體，這說(shuō)明Ru-Indole誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的自噬。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，我們使用蛋白免疫印跡法研究了配合物處理HeLa細(xì)胞后自噬蛋白LC3表達(dá)量的變化。圖6B實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞相比，加入 10 μmol·L-1的Ru-Indole處理24 h后，LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯提高。并且隨著配合物Ru-Indole濃度的增加，LC3-Ⅱ表達(dá)量的增加呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢(shì)，同時(shí)wⅡ/wⅠ也明顯增加。使用Image Lab軟件計(jì)算定量分析后(圖6C)可以看出，隨著Ru-Indole濃度的增加，wⅡ/wⅠ明顯增加，配合物濃度與自噬水平之間存在劑量依賴關(guān)系，相對(duì)于0 μmol·L-1，Ru-Indole濃度為40 μmol·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)量提高了13倍之多。以上實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果表明配合物Ru-Indole也可以通過(guò)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬的方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

圖6 配合物Ru-Indole誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬:(A)共聚焦顯微鏡成像圖;(B)蛋白印跡法成像圖;(C)LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ蛋白定量統(tǒng)計(jì)圖Fig.6 Autophagy induced by Ru-Indole:(A)confocal microscopy imaging;(B)western blot imaging;(C)ratio of LC3-Ⅱto LC3-Ⅰ (wⅡ/wⅠ)treated with Ru-Indole at different concentrations

3 結(jié) 論

我們將無(wú)毒性的吲哚類衍生物進(jìn)行化學(xué)修飾后引入到同樣無(wú)毒的二聯(lián)吡啶釕前體中，得到了抗腫瘤活性明顯提高的釕配合物Ru-Indole，并對(duì)配合物的抗腫瘤機(jī)理進(jìn)行了深入研究。研究結(jié)果表明，與配體及配合物前體相比，配合物Ru-Indole對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒活性有了極大的提高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)配合物可富集在線粒體和溶酶體中，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的降低，通過(guò)線粒體通路引起細(xì)胞死亡。同時(shí)通過(guò)激光共聚焦成像及蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)配合物Ru-Indole還會(huì)引起腫瘤細(xì)胞的自噬從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡?？傊瑢⑦胚嵫苌镆氲蕉?lián)吡啶釕配合物中，不僅提高了釕配合物的抗腫瘤活性，而且拓展了吲哚衍生物在配合物中的應(yīng)用，為新型聯(lián)吡啶釕配合物在抗腫瘤方面的應(yīng)用提供了一定的指導(dǎo)作用。