王桂蓮,李 敏,2,王 靜

(1.北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,寧夏 銀川 750021;2.北方民族大學(xué) 寧夏葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心,寧夏 銀川 750021)

近年來,由化感自毒作用誘發(fā)的連作障礙成因及治理是農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題之一[1-2].化感自毒作用指作物向周圍環(huán)境(主要是土壤介質(zhì))釋放出化學(xué)物質(zhì),該類化學(xué)物質(zhì)的累積會(huì)對(duì)同茬或下茬作物的生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響[3].對(duì)西瓜多年連作土壤進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),阿魏酸、香豆酸、香草酸等酚酸類物質(zhì)是存在于根系土壤中的主要自毒物質(zhì)[4-7].酚酸是一類苯環(huán)上帶有活性羧酸基團(tuán)的小分子有機(jī)酸,在植物體內(nèi)可通過莽草酸途徑合成[8].自然條件下,該類物質(zhì)通過雨露淋溶,根系分泌和殘?bào)w腐解等形式進(jìn)入周圍環(huán)境,積累到一定量時(shí)即對(duì)植物產(chǎn)生顯著的化感自毒作用.

在自毒物質(zhì)的防治領(lǐng)域與輪作、嫁接和增施有機(jī)肥等措施相比,向土壤中添加有益微生物降解賦存于作物根系的自毒物質(zhì),是一種更為徹底有效的防治措施.其中,獲得能夠在作物根系定殖的酚酸類物質(zhì)高效降解菌株是關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)之一.本文以粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)為生物材料,研究其對(duì)西瓜根系主要自毒物質(zhì)阿魏酸、p-香豆酸、香草酸和丁香酸的降解效能,并探明該菌在西瓜根部的定殖能力,以期為該菌進(jìn)一步應(yīng)用于酚酸類自毒物質(zhì)的防治奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

阿魏酸、香豆酸、香酸草、丁香酸、利福平、二甲基亞砜等藥品購自阿拉丁試劑(上海)有限公司,均為分析純(≥98%).氯化汞(上海廣諾化學(xué)科技有限公司).色譜分析用甲醇為色譜純(Sigma-Aldrich);超純水(電阻率大于18 MΩ·cm)由實(shí)驗(yàn)室純水儀制備.

西瓜種子(金城5號(hào))為寧夏中衛(wèi)香山硒砂瓜主要栽培品種.

粘紅酵母A3為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種.

1.2 降解效能定量測(cè)定

將甘油凍存菌株接種至Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基,30 ℃,150 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,取一定體積菌液離心,棄去上清液后用無菌水制備成菌懸液.將菌懸液加入含50 mg/L酚酸的降解培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配置參照文獻(xiàn)[9]),使培養(yǎng)基中菌細(xì)胞初始濃度達(dá)到108CFU/mL,于150 r/min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng),定時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)基中菌細(xì)胞數(shù)量和酚酸濃度.菌細(xì)胞數(shù)量采用紫外-可見分光光度計(jì)680 nm處的吸光度值定量表征.酚酸化合物定量分析采用高效液相色譜儀(Agilent 1200)串聯(lián)二極管陣列檢測(cè)器(DAD,G1315B),色譜柱為Agilent ZORBAX RX-C18、4.6×150 mm、5μm;液相色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇-0.1%乙酸溶液(50/50,v/v),流速 0.5 mL/min,進(jìn)樣量：10 μL;其中,阿魏酸檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm,保留時(shí)間4.136 min;丁香酸檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm;保留時(shí)間3.525 min;香草酸檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm,保留時(shí)間3.559 min;香豆酸檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm,保留時(shí)間4.046 min.

1.3 A3R在西瓜根系土壤中的定殖

1.3.1 菌株A3的利福平(Rifampicin,以下簡(jiǎn)稱 Rif)抗性標(biāo)記

采用包含Rif漸進(jìn)濃度分別為5,10,20,40,60,80,100,200和300 μg·mL-1的LB培養(yǎng)基逐級(jí)馴化菌株A3,直至獲得能夠耐受300 μg·mL-1Rif,且對(duì)酚酸類物質(zhì)降解性能不變的突變菌株A3R.取A3R單菌落,接種于不含Rif的LB培養(yǎng)基,30℃,150 r/min-1恒溫振蕩培養(yǎng)12 h,取培養(yǎng)液再接種于不含Rif的LB培養(yǎng)基中,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng),如此重復(fù)至96 h后,取100 μL培養(yǎng)液,涂布于無Rif的LB平板上,隨機(jī)選取100個(gè)單菌落轉(zhuǎn)入含300 μg·mL-1Rif的抗生素平板,以抗性菌株所占百分比計(jì)算標(biāo)記菌株A3R的遺傳穩(wěn)定性.

抗性標(biāo)記菌株A3R的降解效能測(cè)定參照1.2中的要求.

1.3.2 標(biāo)記菌株A3R在土培西瓜根部的的定殖檢測(cè)

清洗西瓜種子,用無菌水浸泡6 h后,采用0.01 g/L氯化汞溶液處理8 min,再用無菌水漂洗6次,將種子放入無菌培養(yǎng)皿中的濕濾紙床中,在28 ℃黑暗環(huán)境培養(yǎng)至種子露白.將露白種子轉(zhuǎn)移至裝有滅菌栽培土的育苗盆中,在種子附近施1 mL濃度為1×108cfu/mLA3R菌液,等量無菌水為對(duì)照,然后覆蓋厚度為1 cm的滅菌栽培土.每個(gè)處理3個(gè)平行.移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng),培養(yǎng)條件28 ℃,光周期12 h光照/12 h黑暗.培養(yǎng)7 d后第一次采樣,之后每隔4 d取樣1次,每次取3株,連續(xù)取7次,參照王靜[10]方法分別取根際土和根表土測(cè)定標(biāo)記回收菌株A3RC,換算定殖密度.

標(biāo)記回收菌株A3RC的降解效能測(cè)定參照.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株A3對(duì)酚酸類化合物的降解效能

4種酚酸化合物的分子結(jié)構(gòu)信息如表1所示,菌株A3對(duì)它們的降解性能如圖1所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,菌株A3對(duì)p-香豆酸、阿魏酸和香草酸表現(xiàn)出較高降解能力,經(jīng)6～8 h后降解率可達(dá)98%以上;而菌株對(duì)丁香酸的降解能力最弱,經(jīng)22 h后體系中仍有50%的丁香酸殘留.對(duì)比p-香豆酸和阿魏酸的分子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),二者除了苯環(huán)3號(hào)位取代基不同外,其余結(jié)構(gòu)均一致;其中,前者3號(hào)位無取代基,后者3號(hào)位有甲氧基取代基,因此推測(cè)甲氧基的存在對(duì)菌株A3轉(zhuǎn)化利用該類化合物略有阻礙作用.對(duì)比阿魏酸和香草酸的分子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),二者除苯環(huán)1號(hào)位取代基類型不同外,其余結(jié)構(gòu)均一致;其中,前者1號(hào)位為丙烯酸基團(tuán),后者為羧基,由此推測(cè)苯環(huán)1號(hào)位為丙烯酸基團(tuán),有利于菌株A3的降解轉(zhuǎn)化.丁香酸苯環(huán)3、4和5號(hào)位分別存在甲氧基、羥基和甲氧基,推測(cè)上述取代基的存在限制了菌株A3對(duì)其的降解效能.綜上可知菌株A3對(duì)4種化合物降解轉(zhuǎn)化效能的強(qiáng)弱與分子結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān).

表1 4種酚酸化合物分子結(jié)構(gòu)信息

圖1 菌株A3對(duì)酚酸底物的降解活性

2.2 菌株A3在西瓜根部的定殖

2.2.1 標(biāo)記菌株A3R的篩選

逐步提高Rif濃度,獲得能夠在300 μg/mLRif LB培養(yǎng)基生長(zhǎng)的標(biāo)記菌株A3R,經(jīng)不含Rif的LB 液體培養(yǎng)基連續(xù)轉(zhuǎn)接8次后涂布于LB培養(yǎng)基,隨機(jī)挑取100個(gè)菌落,發(fā)現(xiàn)其均可以在含有300 μg/mL Rif的LB培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng),生長(zhǎng)情況如圖2所示.可見標(biāo)記菌株A3R的Rif標(biāo)記穩(wěn)定性強(qiáng).

圖2 菌株A3R在含有300 μg/mLRif的LB平板上的生長(zhǎng)情況

2.2.2 標(biāo)記菌株A3R在西瓜根部的定殖能力

圖3 菌株A3R在西瓜根系土壤中的定殖動(dòng)態(tài)

經(jīng)A3R菌液澆灌西瓜種子,培養(yǎng)7 d后開始采樣測(cè)定標(biāo)記菌株A3R在西瓜幼苗根際土和根表土中的含量,結(jié)果如圖3所示.第一次取樣(7 d)標(biāo)記菌株A3R在根際土和根表土中的含量均達(dá)到最高,分別達(dá) 1.32×105cfu/g和2.94×104cfu/g;在培養(yǎng)7 d～19 d內(nèi),菌密度呈明顯下降趨勢(shì);19 d后,菌體密度逐漸趨于穩(wěn)定,分別維持在2.26×104cfu/g和7.04×103cfu/g左右.將從根際土和根表土中回收的菌株標(biāo)記為A3RC,驗(yàn)證回收菌株對(duì)酚酸化合物的降解性能.

2.2.3 菌株A3RC對(duì)酚酸化合物降解性能的驗(yàn)證

考察菌株A3RC對(duì)4種酚酸化合物的降解性能,并與菌株A3及A3R進(jìn)行比對(duì),結(jié)果如圖4所示.各個(gè)降解體系中菌株A3,A3R及A3RC對(duì)酚酸的降解能力和菌體的生長(zhǎng)狀況基本一致.采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)各降解體系中酚酸化合物的殘留情況進(jìn)行分析,對(duì)于阿魏酸(圖4(a))和p-香豆酸(圖4(b)),降解4 h后菌株 A3R和A3RC與原菌株A3存在顯著性差異(P<0.05),但降解6 h后差異消失;對(duì)于丁香酸(圖4(d)),降解2、4和6 h菌株 A3R和A3RC與原菌株A3存在顯著性差異(P<0.05),但其余組均無差異;總體而言,上述出現(xiàn)差異組的占比很小.可見標(biāo)記菌株A3R和回收菌株A3RC與原菌株A3對(duì)4種酚酸化合物的降解效能一致.

圖4 菌株A3,Rif標(biāo)記菌A3R和西瓜根系土壤定殖回收菌A3RC的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

3 討論

植物根系能夠向外分泌糖、氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì),但同時(shí)亦能合成并分泌對(duì)自身有害的物質(zhì),引起化感自毒作用[11-13].已有研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌(Pseudomonassp.)[14],葡萄球菌(Staphylococcussp.)[15],不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.)[16],曲霉菌(Aspergillussp.)[17]等對(duì)酚酸類化合物表現(xiàn)出高效降解能力,此方面的成果尤以國內(nèi)學(xué)者研究報(bào)道居多.Zhang[14]亦發(fā)現(xiàn)粘紅酵母菌(Rhodotorulaglutinis)經(jīng)48 h對(duì)1 g/Lp-香豆酸降解效率達(dá)70%～99%.但上述研究均聚焦于降解速率的檢測(cè),外界環(huán)境因素對(duì)降解效能的干擾,未能關(guān)注到有益微生物在植物根部土壤中大量定殖,是其在自然環(huán)境中發(fā)揮降解轉(zhuǎn)化自毒物質(zhì)作用的先決條件.本研究以實(shí)驗(yàn)室保存菌株粘紅酵母A3為生物材料,研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)p-香豆酸、香草酸、阿魏酸具有高效降解能力,對(duì)丁香酸的降解效果較弱.通過抗生素利福平Rif標(biāo)記菌株A3后進(jìn)行定殖實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示施加A3R菌株26 d后,標(biāo)記菌株A3R在根際土和根表土的定殖密度分別為105和104cfu/g,推測(cè)A3R在西瓜根系定殖成功.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)粘紅酵母菌A3在酚酸類物質(zhì)積累的連作土壤修復(fù)領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值,值得進(jìn)一步研究開發(fā).