張艷雯 玉發(fā)楊 黃福標(biāo) 譚春萍 于冬玲

摘? 要：為研究白細(xì)胞介素2和白細(xì)胞介素18對雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗免疫作用的影響，將84只14日齡無特定病原（SPF）雞隨機分為7組，每組12只;分別設(shè)為NDV-IBV二聯(lián)活疫苗組（對照組）、CHIL-2蛋白+NDV-IBV二聯(lián)活疫苗免疫增強組、pVAX1-CHIL-2+NDV-IBV二聯(lián)活疫苗免疫增強組、CHIL-18蛋白+NDV-IBV二聯(lián)活疫苗免疫增強組、pVAX1-ChIL-18+NDV-IBV二聯(lián)活疫苗免疫增強組、CHIL-2蛋白+CHIL-18蛋白+NDV-IBV二聯(lián)活疫苗免疫增強組、pVAX1-CHIL2+pVAX1-ChIL-18+NDV-IBV二聯(lián)活疫苗免疫增強組。7組雞均于14日齡進(jìn)行免疫注射，并于免疫后第0、7、14、21、28、35和42天時對各組雞進(jìn)行采血并測定血清中NDV和IBV抗體水平。免疫第48 天后每組雞隨機挑取12只進(jìn)行動物攻毒保護(hù)試驗。結(jié)果表明，CHIL-2和CHIL-18不僅能夠顯著增強NDV-IBV二聯(lián)活疫苗所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而且還可以明顯提高疫苗的保護(hù)率。

關(guān)鍵詞：白細(xì)胞介素2;白細(xì)胞介素18;疫苗;免疫效果

中圖分類號：S858.312.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B? ? 文章編號：1673-1085（2021）2-0005-05

白細(xì)胞介素2（IL-2）和白細(xì)胞介素18（IL-18）是機體重要的細(xì)胞因子[1，2]，二者不僅能夠提高NK細(xì)胞（natural killer cell，NK）和T細(xì)胞（T-lymphocyte）殺傷活性，促進(jìn)γ-干擾素（IFN-γ）的產(chǎn)生，刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且在介導(dǎo)細(xì)胞免疫、抵抗微生物感染、提高疫苗免疫保護(hù)水平的潛能方面具有重要作用[3-5]。前期作者已成功重組原核表達(dá)并純化了CHIL-2蛋白和ChIL-18蛋白，并構(gòu)建了雞pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18真核表達(dá)質(zhì)粒，已證明其在體外細(xì)胞中成功表達(dá)[6]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步展開對重組原核表達(dá)產(chǎn)物ChIL-2和ChIL-18蛋白以及真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18在雞體內(nèi)對疫苗免疫增強作用的研究，為IL-2和IL-18作為家禽疫苗佐劑及免疫增強劑應(yīng)用于生產(chǎn)實踐奠定一定理論基礎(chǔ)。

1? 材料和方法

1.1? 試驗材料? 重組雞白細(xì)胞介素2（ChIL-2）蛋白和重組雞白細(xì)胞介素18（ChIL-18）蛋白;真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18;14日齡SPF雛雞購自九江博美萊生物制品有限公司;雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（NDV-IBV; La Sota+H120株）購自九江博美萊生物制品有限公司;NDV F48E9株，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.2? 試驗設(shè)計? 14日齡無特定病原（SPF）雞84只，隨機分為7組，每組12只。其中，1組為NDV-IBV二聯(lián)活疫苗對照組，2組為CHIL-2蛋白免疫增強組，3組為pVAX1-CHIL-2免疫增強組，4組為重組CHIL-18蛋白免疫增強組，5組為pVAX1-ChIL-18免疫增強組，6組為重組CHIL-2蛋白+ CHIL-18蛋白免疫增強組，7組為pVAX1-CHIL-2+pVAX1-ChIL-18免疫增強組，見表1。

7組雞均于14日齡按表1所示劑量進(jìn)行注射，其中疫苗采用滴鼻點眼，其他樣品進(jìn)行腿部肌肉分點注射，并于接種前1 d和接種后第0、7、14、21、28、42天時翼下靜脈或心臟采非抗凝血分離血清。

1.3? 血清NDV抗體檢測? 采用血凝抑制試驗（HI）對采集的血清樣品進(jìn)行NDV免疫抗體水平檢測。

1.4? 血清IBV抗體檢測? 用ELISA法測定血清中IBV抗體水平。

1.5? 攻毒感染試驗? 免疫后第48天，用滅菌生理鹽水將新城疫強毒株F48E9稀釋至106 LD50/mL，對各組雞通過點眼滴鼻途徑攻毒，每只0.1 mL，然后觀察并記錄雞群的精神狀態(tài)、飲食狀況及死亡情況，死亡后剖檢并記錄病理變化。攻毒后第7天撲殺存活雞只，剖檢并記錄病理變化。

2? 試驗結(jié)果

2.1? 血清中NDV抗體水平檢測結(jié)果? 見圖1。

由圖1可知，各免疫增強組雞的NDV抗體水平均高于NDV-IBV疫苗對照組（1組）;各免疫增強組雞NDV免疫抗體水平在0～7 d時快速上升，于21 d時達(dá)到峰值，第21天后開始緩慢下降。第7～42天，pVAX1-CHIL-2+pVAX1-ChIL-18免疫增強組（7組）和重組CHIL-2蛋白+重組CHIL-18蛋白免疫增強組（6組）的抗體水平仍顯著高于其他各免疫組（2、3、4、5組）（P<0.05）。

2.2? 血清中IBV抗體水平檢測結(jié)果? 見圖2。

由圖2可知，各免疫增強組雞的IBV抗體水平均高于NDV-IBV疫苗對照組（1組）;各免疫增強組雞IBV免疫抗體水平在0～7 d時快速上升，于21 d時達(dá)到峰值，之后緩慢下降。第28～42天，pVAX1-CHIL2+pVAX1-ChIL-18免疫增強組（7組）的抗體水平仍明顯高于其他各組（P<0.05）。

2.3? ChIL-2和ChIL-18對NDV-IBV疫苗抗病毒攻毒結(jié)果? 結(jié)果顯示，NDV-IBV疫苗組中12只雞有3只發(fā)病死亡，疫苗保護(hù)率為75%;CHIL-2、CHIL-18蛋白組有2只發(fā)病，但未死亡，保護(hù)率為84%;CHI-2+CHIL-18蛋白組、pVAX1-CHIL2、pVAX1-ChIL-18和pVAX1-CHIL2+pVAX1-ChIL-18質(zhì)粒組各有1只雞發(fā)病，未死亡，保護(hù)率為99.2%。

3? 討論

本試驗發(fā)現(xiàn)，各免疫增強組雞的NDV和IBD抗體水平均高于NDV-IBV疫苗對照組（1組），表明ChIL-2和ChIL-18對NDV-IBV疫苗有明顯的免疫增強作用，改善免疫應(yīng)答，這與其他學(xué)者研究結(jié)果相似。費聿鋒等[7]將原核表達(dá)的重組ChIL-2與雞的四聯(lián)油苗同時使用，能顯著提高新城疫和禽流感的抗體效價，并具有明顯的免疫增強作用;王彥彬等[8]研究表明，重組IL-2蛋白具有增強新城疫疫苗免疫效果的作用，提高了血清中抗體水平、T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+亞群水平、CD4+/CD8+的比值，且部分指標(biāo)差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）;姜文博等研究發(fā)現(xiàn)，ChIL-18蛋白不僅對新城疫疫苗誘導(dǎo)的HI抗體有增強作用[9]，而且顯著增強新城疫疫苗所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，明顯提高疫苗的保護(hù)率[10]。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，用pVAX1-CHIL2和pVAX1-ChIL-18真核表達(dá)質(zhì)粒與疫苗共同免疫，其抗體水平要高于用ChIL-2和ChIL-18原核表達(dá)蛋白的。說明真核表達(dá)質(zhì)粒的免疫增強效果更好。Hulse等[11]將重組雞IL-2真核質(zhì)粒DNA與IBDV表面蛋白的VP2基因的質(zhì)粒共同免疫，結(jié)果表明IL-2質(zhì)粒免疫組可以提高抗原提呈細(xì)胞數(shù)量，在強毒攻擊時，能顯著提高免疫保護(hù)效力。Wang等[12]利用重組的rVP2-IL-2 靶向融合蛋白免疫雞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rVP2-IL-2 融合蛋白免疫雞體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平均明顯高于單獨的VP2蛋白免疫組，雞體能產(chǎn)生一個平衡的IgG1和IgG2a抗體反應(yīng)。攻毒試驗表明，rVp2-IL-2 融合蛋白免疫組雞體獲得了85%的保護(hù)率，表明構(gòu)建的rVP2-IL-2融合蛋白對IBDV的攻擊具有較好的免疫保護(hù)作用。

本試驗發(fā)現(xiàn)，pVAX1-CHIL-2+pVAX1-ChIL-18免疫增強組（7組）和重組CHIL-2蛋白+重組CHIL-18蛋白免疫增強組（6組）的NDV、IBD抗體水平顯著高于其他免疫組（2、3、4、5組），表明CHIL-2和ChIL-18協(xié)同提高疫苗的免疫增強作用優(yōu)于單獨注射CHIL-2和ChIL-18。這可能是因為IL-2和IL-18都具有激活T細(xì)胞、促進(jìn)B細(xì)胞分化及分泌抗體、誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生、增強單核細(xì)胞以及NK細(xì)胞的殺傷活性的作用[3，13-15];二者不僅對免疫細(xì)胞具有較強的免疫刺激作用，而且協(xié)同疫苗進(jìn)行配合免疫，增強免疫效果顯著。

參考文獻(xiàn)：

[1]? Blachère N E，Morris H K，Braun D，et al. IL-2 is required for the activation of memory CD8+ T cells via antigen cross-presentation[J]. The Journal of Immunology，2006，176（12）2：7288-7300.

[2]? Rochman Y，Spolski R，Leonard W J. New insights into the regulation of T cells by γ c family cytokines[J].Nature Reviews Immunology，2009，9（7）：480-490.

[3]? Siegel J P，Sharon M，Smith P L，et al. The IL-2 receptor beta chain （p70）：role in mediating signals for LAK，NK，and proliferative activities[J]. Science，1987，238（4823）：75-78

[4]? 李宏梅，胡敬東，郭慧君，等. 重組雞白細(xì)胞介素18（rChIL-18）對MDV感染SPF雞細(xì)胞免疫的影響[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2007，27（5）：624-627.

[5]? 劉梅芬， 李勤楠， 馬震原，等. 重組雞白細(xì)胞介素-6/2融合蛋白對新城疫（La Sota株）活疫苗免疫增強作用研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2019，46（2）：590-599.

[6]? 張艷雯，張鶴曦，覃靜等.雞白細(xì)胞介素2和18基因的原核和真核表達(dá)[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，33（12）：2975-2982.

[7]? 費聿鋒， 錢建飛， 凌雯，等. 重組雞IL-2增強雞四聯(lián)滅活苗免疫效果的研究[J]. 畜牧與獸醫(yī)， 2004， 36（4）：9-11.

[8]? 王彥彬， 閆峰賓， 康相濤. 重組雞IL-2對新城疫滅活苗免疫效果的影響[A]. 中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家禽學(xué)分會.中國家禽科學(xué)研究進(jìn)展--第十四次全國家禽科學(xué)學(xué)術(shù)討論會論文集[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家禽學(xué)分會：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會，2009：4.

[9]? 姜文博， 孫進(jìn)華， 單安山. 雞IL-18基因的克隆表達(dá)及對新城疫疫苗誘導(dǎo)的HI抗體變化的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009， 40（5）：75-79.

[10]? 趙敏， 張春杰， 程相朝，等. 重組雞IL-18對新城疫疫苗免疫增強作用的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2011， 33（4）：761-764.

[11]? Hulse D J ，Romero C H .Partial protection against infectious bursal disease virus through DNA-mediated vaccination with the VP2 capsid protein and chicken IL-2 genes[J]. Vaccine， 2004， 22（9-10）：1249-1259.

[12]? Wang C ， Zhao Z ， Zhang C ， et al. Influence of fusion protein of IBDV VP2 and chicken Interleukin-2 on immune response in chicken[J]. Chinese Journal of Biotechnology，2010，26（4）：476-482.

[13]? Okamura H，Tsutsui H，Kashiwamura S，et al. Interleukin-18：A novel cytokine that augments both innate and acquired immunity[J]. Advances in Immunology，1998，70：281-312.

[14]? Tse B W C，Russell P J，Lochner M，et al. IL-18 inhibits growth of murine orthotopic prostate carcinomas via both adaptive and innate immune mechanisms[J]. PLoS One，2011，6（9）：e24241.

[15]? Tian H，Shi G，Yang G，et al.Cellular immunotherapy using irradiated lung cancer cell vaccine co-expressing GM-CSF and IL-18 can induce significant antitumor effects[J].BMC Cancer，2014，14（1）：1-13.

Effects of leciocyte interleulin 2 and lecierocyte 18 on the immune effects of the Newcastale Disease and Infectious Bronchitis Live Vaccine

ZHANG Yanwen1，YU Fayang2，HUANG Fubiao1，TAN Chunping1，YU Dongling1

（1.Nanning University，Guangxi 530200，China;

2.Integrated Service Center of Agriculture，F(xiàn)orestry and Water Conservancy of Zhonghe Town of Yongning District in Nanning City，Guangxi 530209，China）

Abstract：For the study of the effects of lecierocyte interleulin 2 and lecierocyte interleulin 18 on the immune effects of Newcastale Disease and Infectious Bronchitis Live Vaccine， 84 SPF chickens were randomly divided into 7 groups with 12 chickens in each group. The NDV-IBV vaccine group， the NDV-IBV vaccine + CHIL-2 group， the NDV-IBV vaccine + pVAX1-CHIL-2 group， the NDV-IBV vaccine + CHIL-18 group， the NDV-IBV vaccine + pVAX1-CHIL-18 group， the NDV-IBV vaccine + CHIL-18+ CHIL-2 group， the NDV-IBV vaccine +pVAX1-CHIL2+pVAX1-ChIL-18 group.? all groups were immunized at 14 days of age， and blood samples were collected at 0， 7， 14， 21， 28， 35 and 42 days， and the serum antibody levels of NDV and IBV were determined On the 48th day after immunization， 12 chickens in each group were randomly selected for animal protection test. The results indicated that ChIL-2 and ChIL-18 could not only significantly enhance the immune response induced by NDV-IBV vaccine， but also significantly improve the protection rate of the vaccine.

Keywords： interleukin-2（ChIL-2）;interleukin-18（ChIL-18）;vaccine; immune effect

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