孫 瑩，王 萌，王靖雷，孫曉軍，馬 睿，余四九，潘陽陽*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730050）

細(xì)胞色素P450（CytochromeP450，CYP450）是可以自身氧化的亞鐵血紅蛋白家族，該家族成員覆蓋了所有生物體，主要分布于細(xì)胞線粒體內(nèi)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是內(nèi)、外源性物質(zhì)及致癌性物質(zhì)代謝過程中的關(guān)鍵酶，參與生物體內(nèi)甾醇類激素合成的過程[1,2]。有研究表明，在女性生長(zhǎng)發(fā)育過程中，缺乏細(xì)胞色素P450氧化還原酶會(huì)引起成年女性月經(jīng)紊亂，甚至出現(xiàn)不孕現(xiàn)象[3]。哺乳動(dòng)物卵巢的每個(gè)生理周期均會(huì)排出處于成熟階段的卵泡用于受精，卵巢對(duì)雌性動(dòng)物的生殖能力起決定性作用。由此可見，提高卵巢生理功能是目前研究的重點(diǎn)目標(biāo)。

CYP11A1作為細(xì)胞色素P450家族的成員，參與催化生物轉(zhuǎn)化、生物合成的過程[4]。在分子水平上，細(xì)胞色素P450CYP11A1通過裂解膽固醇側(cè)鏈，催化合成類固醇激素的前體——孕烯醇酮（Pregnenolone），促進(jìn)卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞的成熟[5,6]。有研究表明：CYP11A1的酶活性會(huì)受到雌激素、孕酮的調(diào)控，如雌二醇會(huì)影響孕烯醇酮的形成，具有促進(jìn)卵巢發(fā)育、排卵的功能，與動(dòng)物生長(zhǎng)繁殖也密切相關(guān)[3][7,8]。

牦牛（Bos grunniens）是中國(guó)以青藏高原為中心的珍稀牛種之一[9,10]。它在低溫高海拔、紫外線強(qiáng)的生態(tài)環(huán)境中生存，為牧民提供皮毛、牛奶、肉制品等多種生物制品，創(chuàng)造了極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但牦牛生產(chǎn)性能較低，90%以上的雌性牦牛產(chǎn)后同年無法發(fā)情，三年兩胎，甚至兩年一胎，生產(chǎn)過程極具局限性[11,12]。前有研究證明CYP11A1對(duì)家禽、藏豬、小尾寒羊等多種動(dòng)物的生殖生理均有所影響，但在牦牛中未見報(bào)道[13,14]。因此，本研究以牦牛不同發(fā)育階段的卵泡、COCs為模型，應(yīng)用qRT-PCR、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CYP11A1的表達(dá)水平及位置分布，為進(jìn)一步了解哺乳動(dòng)物、反芻動(dòng)物生殖生理的特異性奠定了基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 主要試劑

磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco’s phosphate buffered saline，D-PBS）購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)于PAN公司（澳大利亞）；TransZol RNA提取試劑盒（TransGen，北京）；Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ（艾科瑞生物，湖南）；SYBR GreenⅡ熒光定量PCR試劑盒（寶生物，大連）；CYP11A1 Antibody（親科生物，常州）、免疫熒光檢測(cè)試劑購(gòu)于南京碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集

2020年8—12月從青海省西寧市馬佳肴屠宰場(chǎng)采集牦牛卵巢，置于裝有35℃生理鹽水（含青鏈霉素）的保溫壺中，4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。37℃生理鹽水（含青鏈霉素）清洗3遍，用帶有18G針頭的注射器抽取卵巢表面2～8 mm卵泡中的卵泡液，然后與提前37℃恒溫箱內(nèi)平衡的采卵液（D-PBS＋5%FBS）混勻；混合后的采卵液倒入50 mm培養(yǎng)皿中，靜置后在體視顯微鏡下?lián)炻?，并將卵移入裝有37℃采卵液的培養(yǎng)皿中清洗3次，再轉(zhuǎn)入卵母細(xì)胞成熟的培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別收集未成熟卵母細(xì)胞（0 h）、成熟12 h、成熟18 h的卵母細(xì)胞以及成熟卵母細(xì)胞（24 h）各40枚，將每個(gè)階段收集的40枚卵母細(xì)胞分為2份，一份用于提取RNA，-80℃保存，另一份置于固定液用于后續(xù)免疫熒光染色。

1.3 牦牛COCs及卵泡液RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)TransZol RNA提取試劑盒說明書提示，分別提取不同成熟階段（0 h、12 h、18 h和24 h）COCs的RNA，且分別在卵泡大小為0～3 mm、3～5 mm、5～8 mm和＞8 mm時(shí)提取卵泡液的RNA，再利用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ?qū)⑵溥M(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成相應(yīng)的cDNA，分別存于-20℃，用于后續(xù)qRT-PCR檢測(cè)。

1.4 引物設(shè)計(jì)

參考GenBank上所公布的牛的CYP11A1基因序列（NM_176644.2），使用軟件Primer 5 設(shè)計(jì)引物，并將肌動(dòng)蛋白β-Actin基因（DQ838049.1）設(shè)為內(nèi)參基因，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，詳細(xì)信息及反應(yīng)條件見表1。

表1 CYP11A1引物信息

1.5 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)CYP11A1基因的相對(duì)表達(dá)量

使用LightCycler?96 SW 1.1（Roch，Switzerland）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。反應(yīng)體系為模板cDNA 1 μl（500 ng/μl），上、下游引物各0.5μl（0.2 μmol/ml），2*SYBR Green PCRmix 10 μl，補(bǔ)加ddH2O 8 μl使體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性10 s、退火10 s（具體溫度見表1）、72℃延伸10 s，重復(fù)共40個(gè)循環(huán)，建立4個(gè)重復(fù)，β-Actin為內(nèi)參，根據(jù)熔解曲線確定反應(yīng)特異性，利用所得每個(gè)樣品的循環(huán)閾值（Ct值），通過2-ΔΔCt法分析qRT-PCR所得數(shù)據(jù)，檢測(cè)CYP11A1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)CYP11A1的表達(dá)定位

采用免疫熒光染色對(duì)COCs的CYP11A1蛋白進(jìn)行定位檢測(cè)，首先對(duì)在4℃用4%多聚甲醛固定后的細(xì)胞進(jìn)行通透處理，使用免疫封閉液孵育1 h，再用CYP11A1抗體4℃孵育過夜，清洗3遍后與二抗孵育結(jié)合，再清洗3遍使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，最后清洗3遍后封片鏡驗(yàn)，用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（oneway，ANOVA），每組至少重復(fù)3遍以上，所有結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用Graphpad prism 7繪制柱狀圖，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 驗(yàn)證CYP11A1引物特異性

2.1.1 核酸電泳檢測(cè)引物特異性 已知CYP11A1、β-Actin PCR產(chǎn)物大小分別為273bp、143bp，以卵泡液、COCs反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物特異性。結(jié)果如圖1所示，片段大小與預(yù)期一致，條帶成像清晰，無非特異性結(jié)合片段，證明該引物特異性良好，可用于后續(xù)qRT-PCR檢測(cè)。

2.1.2 CYP11A1擴(kuò)增所得熔解曲線的結(jié)果 如圖2所示，通過qRT-PCR擴(kuò)增，CYP11A1所得產(chǎn)物的熔解曲線是單峰，且出峰位置即為退火溫度。由此可見，該引物特異性及模板質(zhì)量均良好。

圖1 CYP11A1在卵泡液和卵母細(xì)胞中表達(dá)的核酸電泳結(jié)果

圖2 qRT-PCR檢測(cè)CYP11A1擴(kuò)增所得熔解曲線的結(jié)果

圖3 CYP11A1在不同發(fā)育階段的卵泡液及COCs中的表達(dá)

2.2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，CYP11A1在卵泡及COCs發(fā)育的各時(shí)期均有表達(dá)。在卵泡液中，相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在卵泡大小為3～5 mm時(shí)，表達(dá)量最高；而在COCs中，0 h時(shí)CYP11A1的相對(duì)表達(dá)量最低，12 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高值，之后又呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)。

2.3 免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果

圖4 蛋白CYP11A1在不同發(fā)育時(shí)期的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中的分布

對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的COCs（0 h、12 h、18 h、24 h）進(jìn)行免疫熒光染色處理后，結(jié)果如圖4所示，不同時(shí)期COCs的卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞均表達(dá)CYP11A1，其中在成熟18 h的COCs放射冠中熒光信號(hào)尤為明顯，其表達(dá)位置與骨架蛋白β-Tubulin的位置一致，且通過DAPI細(xì)胞核標(biāo)記顯示，CYP11A1主要在卵丘細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。

3 討論

促性腺激素在哺乳動(dòng)物的早期卵泡生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著不可或缺的作用。由垂體分泌的促卵泡素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH），與卵泡膜上相應(yīng)受體結(jié)合，卵細(xì)胞周圍顆粒細(xì)胞增殖，調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，抑制卵泡閉鎖，促進(jìn)有腔卵泡和排卵前卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育[15,16]。同時(shí)，F(xiàn)SH還具有促進(jìn)雌激素分泌的功能，所分泌雌激素中雌二醇的活性最高，對(duì)第二性征發(fā)育和卵巢排卵有積極的調(diào)控作用[17-19]。卵泡生長(zhǎng)發(fā)育后期會(huì)分泌大量的促黃體生成素（Luteinizing hormone，LH），有助于孕酮的分泌。孕酮又稱為黃體酮，起到調(diào)節(jié)黃體功能、保持受精卵在子宮中著床的位置、防止流產(chǎn)的作用[8]。另外，卵巢顆粒細(xì)胞分泌的孕酮會(huì)受到合成路徑關(guān)鍵酶的影響[20,21]。LH的刺激促進(jìn)類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，有助于促進(jìn)孕酮的合成分泌[22]。該蛋白將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到CYP11A1所在的線粒體內(nèi)膜，由P450CYP11A1基因編碼的細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶對(duì)其側(cè)鏈進(jìn)行裂解，產(chǎn)生孕烯醇酮，孕烯醇酮在CYP11A1脫氫酶活性的作用下發(fā)生雙鍵位置異構(gòu)，生成孕酮[21][23]。由此可見，卵巢中的CYP11A1基因是影響類固醇激素合成的關(guān)鍵調(diào)控基因，與哺乳動(dòng)物繁殖力有關(guān)[7][24]。惡劣的高原環(huán)境可能引起牦牛卵巢損傷和功能障礙，造成了其繁殖性能的特殊性[25]，而本研究表明CYP11A1會(huì)對(duì)牦牛的生長(zhǎng)繁育產(chǎn)生積極影響，對(duì)提高牦牛生產(chǎn)性能具有重要的實(shí)踐意義。

本研究通過利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的卵泡及卵母細(xì)胞中CYP11A1基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示CYP11A1基因在卵泡發(fā)育早期（3～5 mm）表達(dá)量最高，有研究表明雌激素在卵泡發(fā)育早期具有積極的刺激作用，而CYP11A1基因調(diào)控顆粒細(xì)胞分泌雌激素，該機(jī)制與本研究結(jié)果相互對(duì)應(yīng)。CYP11A1參與卵泡發(fā)育的整個(gè)時(shí)期，但主要集中在早期，為卵母細(xì)胞成熟提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是整個(gè)發(fā)育過程的能量來源；在COCs放射冠形成前期，即M-MⅠ期CYP11A1表達(dá)量較高，而后顯著下降，推測(cè)CYP11A1可能參與放射冠的形成。根據(jù)免疫熒光染色結(jié)果來看，CYP11A1在放射冠中的熒光更為明顯，推測(cè)CYP11A1誘導(dǎo)激素分泌，增強(qiáng)卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞間的物質(zhì)代謝，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，但由于CYP11A1蛋白在卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞上均有所分布，不排除卵母細(xì)胞分泌蛋白作用于卵丘細(xì)胞的可能性，具體機(jī)制有待繼續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)在牦牛不同級(jí)別卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟的過程中對(duì)CYP11A1的表達(dá)進(jìn)行定位分析，研究發(fā)現(xiàn)，牦牛卵泡及卵母細(xì)胞不同時(shí)期發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)到CYP11A1的表達(dá)，在早中期表達(dá)量最高，而CYP11A1在COCs中的表達(dá)主要集中在放射冠，推測(cè)CYP11A1參與卵泡的發(fā)生和卵母細(xì)胞的形成，揭示了CYP11A1參與牦牛雌性生殖過程，對(duì)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟均起到積極的調(diào)控作用。