曹海鵬，徐興娜，文小飛

（貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

青貯飼料是指把粉碎的新鮮青綠牧草或秸稈等裝入發(fā)酵池或貯袋，密封后經(jīng)微生物厭氧發(fā)酵而成的一種酸性廉價(jià)飼料，具有酸香多汁、適口性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富及利于貯存等優(yōu)點(diǎn)[1]。此外，青貯飼料還具有貯藏時(shí)間長(zhǎng)、不受季節(jié)限制、營(yíng)養(yǎng)損失少及不易腐敗變質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。大力發(fā)展青貯飼料不僅有利于降低飼養(yǎng)成本，而且可以解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中面臨的秸稈資源難以充分利用、污染環(huán)境等問(wèn)題[2]。影響青貯飼料質(zhì)量的主要因素有青貯原料的結(jié)構(gòu)和含水率，表面微生物的種類(lèi)與數(shù)量，原料的收割時(shí)間、切碎長(zhǎng)度、壓實(shí)程度及密封程度等。其中，表面微生物的種類(lèi)與數(shù)量是決定發(fā)酵成敗的關(guān)鍵因素，而乳酸菌是發(fā)酵的核心微生物[2]。

傳統(tǒng)的青貯飼料是在厭氧條件下自然發(fā)酵而成，一般存在以下問(wèn)題：乳酸菌生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)；不能在短時(shí)間內(nèi)形成優(yōu)勢(shì)菌群，發(fā)酵升酸慢，厭氧雜菌大量繁殖，造成營(yíng)養(yǎng)流失；產(chǎn)生有害氣體或物質(zhì)，適口性差；腐敗菌或霉菌大量生長(zhǎng)，造成原料腐敗或霉變，降低飼料品質(zhì)[3]。因此，青貯期間人為加入適量的乳酸菌能迅速降低發(fā)酵原料的酸度，減少雜菌的生長(zhǎng)，是提高青貯飼料品質(zhì)的有效手段[4]。目前，用于青貯飼料發(fā)酵的乳酸菌種類(lèi)繁多，而生長(zhǎng)快、產(chǎn)酸多而迅速、具有廣譜抑菌功能的乳酸菌有利于加快發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵周期，并抑制雜菌大量繁殖，在青貯飼料制備中具有極強(qiáng)的研究和應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)室前期從豬的腸道黏膜中分離出一株具有廣譜抑菌活性的植物乳桿菌R-21，其為同型乳酸發(fā)酵，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，具有良好的益生性能[5]。因此，本研究擬以具有廣譜抑菌功能的植物乳桿菌R-21為添加劑，以乳熟新鮮玉米秸稈為青貯原料，密封發(fā)酵后檢測(cè)青貯飼料的乳酸菌數(shù)量、pH、含水量及其他感官指標(biāo)，探討植物乳桿菌R-21作為添加劑對(duì)青綠玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的改善效果，以期為植物乳桿菌R-21的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 植物乳桿菌R-21（分離、保藏于貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室）。

1.1.2 青貯原料 貴陽(yáng)周邊新鮮乳熟的全株青綠玉米秸稈。

1.1.3 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏10 g，牛肉膏10 g，吐溫80 1.0 ml，葡萄糖20.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 ml，pH 6.2～6.6，121℃高壓滅菌20 min。固體MRS在此基礎(chǔ)上添加1.5%瓊脂粉[6]。

1.1.4 試劑 主要化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA1003電子天平：力辰科技有限公司；DH6000B電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；XMTA-7000智能恒溫干燥箱：上海景邁儀器設(shè)備有限公司；THZ-82A雙數(shù)顯旋轉(zhuǎn)氣浴振蕩器：金壇市城東新瑞儀器廠；SW-CJ-1G單人凈化工作臺(tái)：上海蘇凈凈化工作臺(tái)；FE20 pH計(jì)：深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種產(chǎn)酸試驗(yàn) 取植物乳桿菌R-21斜面保藏菌種轉(zhuǎn)接于10 ml MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、150 rpm震蕩培養(yǎng)24 h。取2 ml種子液轉(zhuǎn)接于200 ml MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、150 rpm震蕩培養(yǎng)24 h。期間分別取0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h的樣品各5 ml，檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液pH值。余下乳酸菌發(fā)酵液置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 玉米秸稈處理 取乳熟后期新鮮、無(wú)霉變的玉米秸稈全株2 kg，用鍘刀截至長(zhǎng)度2 cm左右再粉碎，加無(wú)菌水至原料含水量約70%，平均分為兩組[7]。

1.3.3 發(fā)酵 在兩組粉碎的玉米秸稈中，一組加入1 ml植物乳桿菌R-21菌液，均勻混勻；另外一組加入1 ml無(wú)菌水。分別裝入1 L的玻璃燒杯中，分層壓緊，盡量裝滿（排除里面的空氣），用三層保鮮膜密封后扎緊封口，并置于室溫下發(fā)酵120 d。

1.3.4 質(zhì)量檢測(cè) 揭開(kāi)保鮮膜，取出發(fā)酵飼料。其中，取1 g飼料梯度稀釋后，采用厭氧罐培養(yǎng)法檢測(cè)其中乳酸菌的活菌數(shù)（colony-forming units,cfu）；使用筆式pH計(jì)檢測(cè)兩組發(fā)酵飼料的pH；現(xiàn)場(chǎng)按德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)青貯感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及等級(jí)評(píng)定方法，從色澤、氣味、質(zhì)地三方面進(jìn)行感官綜合評(píng)價(jià)[2]。

1.3.5 結(jié)果分析 以上數(shù)據(jù)采用Excel 2017文檔進(jìn)行分析、處理與制圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌產(chǎn)酸能力強(qiáng)而迅速時(shí)，其可通過(guò)迅速產(chǎn)生的大量有機(jī)酸來(lái)抑制雜菌（如丁酸菌和腐敗菌）的增殖，以減少原料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失，保證發(fā)酵飼料的質(zhì)量和安全。因此，乳酸菌的產(chǎn)酸能力是青貯飼料發(fā)酵成功的關(guān)鍵因素之一。本研究通過(guò)檢測(cè)植物乳桿菌R-21在發(fā)酵過(guò)程中的pH變化，以判斷其產(chǎn)酸能力強(qiáng)弱。結(jié)果如圖1所示，植物乳桿菌R-21發(fā)酵24 h后，其發(fā)酵液pH由5.4降至3.2，且仍有下降的趨勢(shì)，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，優(yōu)于郝?。?019）所分離的乳酸菌，在青貯中具有一定的應(yīng)用價(jià)值[2]。

圖1 植物乳桿菌R-21發(fā)酵液pH隨時(shí)間變化

2.2 發(fā)酵飼料中乳酸菌數(shù)量及pH

采用厭氧罐培養(yǎng)法檢測(cè)發(fā)酵120 d后飼料中乳酸菌的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值，使用筆式pH計(jì)檢測(cè)兩組發(fā)料飼料的pH。結(jié)果如圖2所示，添加植物乳桿菌R-21的青貯飼料中，其最終的乳酸菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為5.51，比對(duì)照組高2.19；pH約為3.5，較對(duì)照組低0.7。表明植物乳桿菌R-21能顯著增加青貯飼料中乳酸菌活菌的終濃度，并降低其pH（P≤0.05）。乳酸菌濃度和pH是衡量青貯飼料優(yōu)劣的兩個(gè)重要指標(biāo)。一般情況下，乳酸菌濃度越高，其產(chǎn)酸能力越強(qiáng)，越有利于維持飼料的生物穩(wěn)定性。乳酸菌是益生菌，有利于促進(jìn)動(dòng)物腸道健康，增強(qiáng)動(dòng)物非特異免疫力，預(yù)防與治療細(xì)菌性腹瀉，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

圖2 發(fā)酵后的乳酸菌濃度與pH

2.3 青貯飼料的感官指標(biāo)結(jié)果

將發(fā)酵120 d的青貯飼料按德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)青貯感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及等級(jí)評(píng)定方法，從色澤、氣味、質(zhì)地三方面進(jìn)行感官綜合評(píng)價(jià)。具體評(píng)價(jià)結(jié)果如表1所示，添加植物乳桿菌R-21的發(fā)酵飼料在氣味、色澤、質(zhì)地三方面的各個(gè)指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組，與郝?。?019）、張旭（2019）等研究結(jié)果一致，表明添加乳酸菌能顯著改善青貯發(fā)酵飼料的品質(zhì)[2,3]。

表1 發(fā)酵青貯飼料感官指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將植物乳桿菌R-21接種到粉碎的青綠玉米秸稈中，發(fā)酵120 d后，青貯飼料中乳酸菌的數(shù)量明顯高于對(duì)照組，而pH低于對(duì)照組（P≤0.05），飼料感官總體為酸香舒適、青綠色及濕潤(rùn)不粘手，達(dá)到優(yōu)等青貯飼料標(biāo)準(zhǔn)，表明植物乳桿菌R-21作為青貯飼料發(fā)酵添加劑在理論與實(shí)踐中均具有一定的可行性。