李曉明

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

缺血-再灌注損傷是缺血的器官在恢復(fù)動脈血液供應(yīng)后出現(xiàn)的代謝異常、功能障礙及結(jié)構(gòu)破壞等損傷性變化?，F(xiàn)已證實，心、腦、肝、肺、腎、胃腸道和皮膚等多種組織器官都存在缺血-再灌注損傷的現(xiàn)象[1]。雖然缺血-再灌注損傷的發(fā)病機制尚未被徹底闡明，但普遍認為自由基的作用、細胞內(nèi)鈣超載和白細胞的激活是其重要的發(fā)病環(huán)節(jié)[2]。目前，關(guān)于腎臟缺血-再灌注損傷的研究主要集中在自由基含量的變化、損傷機制和抗自由基治療等方面，有關(guān)微循環(huán)中白細胞和微血栓的變化研究甚少。本研究在家兔腎臟缺血-再灌注模型上，通過血管逆流灌注法對腎臟微循環(huán)中滯留的白細胞和微血栓變化進行了探討，并對腎臟的病理損傷進行了觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年中國白兔12只，體重1.5～2.0 kg，雌雄不限。隨機分成對照組和實驗組，每組6只。

1.2 主要儀器與試劑

萊卡切片機，攤片機，顯微鏡，常規(guī)手術(shù)器械，逆流灌注裝置，無損傷動脈夾，血細胞計數(shù)器，20%烏拉坦，1%鹽酸普魯卡因，生理鹽水。

1.3 模型建立

按照5 ml/kg的劑量，給家兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦全身麻醉，仰臥固定在手術(shù)臺上。下腹部剃毛，用1%鹽酸普魯卡因沿腹部白線浸潤麻醉，正中切口打開腹腔，暴露左腎并分離腎動脈。實驗組家兔用無損傷動脈夾夾閉腎動脈，造成左腎缺血，維持40 min后松開動脈夾，恢復(fù)左腎血液再灌注；約90 min后處死動物，取出左腎，進行微循環(huán)中白細胞和微血栓的檢測及腎臟的病理學(xué)觀察。對照組家兔在分離腎動脈后不做其他處理，直接關(guān)閉腹腔，觀察動物一般情況，約130 min后處死動物，進行與實驗組家兔相同的檢測。

1.4 檢測方法

1.4.1 腎微循環(huán)中白細胞和微血栓的檢測 分離并取出左腎，觀察其大小、顏色、質(zhì)地和切面等大體形態(tài)變化，然后分別在腎動脈和腎靜脈斷端插管并結(jié)扎固定；將腎靜脈插管連接在逆流灌注裝置上。灌流液為37℃生理鹽水，壓力50 cmH2O。打開灌注閥，灌流液經(jīng)腎靜脈插管流入腎臟，沿著腎靜脈、腎毛細血管、腎動脈的流向進行逆流灌注，并從腎動脈插管回收灌流液。棄去最初的5 ml灌流液，繼續(xù)收集15 ml，離心（3000 rpm，20 min），棄上清，保留下層液2 ml，搖勻后在顯微鏡下進行白細胞和微血栓計數(shù)（萬/ml）。同時，用混勻的下層液涂片，Wright’s染色法染色，白細胞分類計數(shù)，求出中性粒細胞數(shù)量。

1.4.2 病理學(xué)觀察 從腎臟不同部位取材，10%中性福爾馬林固定。按常規(guī)石蠟切片制作流程，梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切片（厚6 μm），HE染色，光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差表示，用SPSS10.0 for Windows統(tǒng)計學(xué)軟件進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

在整個實驗過程中，對照組和實驗組家兔均未出現(xiàn)意外死亡現(xiàn)象。在手術(shù)過程中，當(dāng)用動脈夾夾閉實驗組家兔的左腎動脈后，左腎的顏色迅速由原來的鮮紅色變成黑紫色；松開動脈夾時，恢復(fù)左腎血液再灌注后，左腎的顏色迅速由黑紫色變?yōu)轷r紅色，說明腎臟的缺血-再灌注模型建立成功。

2.2 中性粒細胞和微血栓數(shù)量的變化

由表1可知，實驗組家兔的左腎在完全缺血40 min后恢復(fù)血液再灌注，經(jīng)過1.5 h后，腎微循環(huán)中滯留的中性粒細胞和微血栓數(shù)量均明顯高于對照組（P＜0.01）。

表1 左腎微循環(huán)中滯留的中性粒細胞和微血栓數(shù)量

2.3 病理變化

尸體解剖可見，實驗組家兔左腎的體積略腫大，顏色暗紅，表面光滑，被膜緊張，但易剝離，腎切面上皮、髓質(zhì)界限清晰；鏡檢可知，腎小球血管團膨大，未見明顯充血、出血，腎球囊狹??；皮質(zhì)部的腎小管上皮細胞彌漫性腫脹，顆粒變性、水泡變性，凸入管腔，使腎小管管腔變小、形狀不規(guī)則；部分區(qū)域的腎小管上皮細胞嚴重壞死、崩解，細胞內(nèi)容物進入腎小管內(nèi)（見圖1）；在皮質(zhì)深層，大部分腎小管腔內(nèi)可見均質(zhì)的蛋白管型（見圖2）。對照組腎臟未見明顯異常。

圖1 腎小管上皮細胞水泡變性、壞死、崩解圖（HE×200）

圖2 部分腎小管內(nèi)均質(zhì)的蛋白管型（HE×200）

3 討論與小結(jié)

在臨床上，缺血-再灌注損傷是許多伴有血液循環(huán)障礙的疾病過程中經(jīng)常出現(xiàn)的一種病理過程，涉及的組織器官種類多，波及范圍廣，對機體的影響大。現(xiàn)已證實心、腦、肝、肺、腎、胃腸道和皮膚等多種組織器官都存在缺血-再灌注損傷的現(xiàn)象[2,3]。腎臟的缺血-再灌注損傷主要見于急性大失血、休克、腎移植和腎動脈栓塞等疾病的救治過程中，常引起嚴重的腎功能損害。在本研究中，通過人為控制實驗組家兔左腎動脈的血流量，模擬了腎臟的缺血和再灌注過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)夾閉左腎動脈后，左腎很快由正常的紫紅色變?yōu)楹谧仙崾灸I動脈血的灌注停止，腎臟處于急性缺血狀態(tài)；當(dāng)打開動脈夾后，左腎的顏色又迅速轉(zhuǎn)為正常的紫紅色，提示動脈血又恢復(fù)了灌注。由此可見，通過人為控制腎動脈的血流量，完全可以模擬腎臟的缺血-再灌注過程，說明該模型的建立是成功的。

目前，盡管缺血-再灌注損傷的發(fā)病機制尚未被徹底闡明，但普遍認為這類以微血管和實質(zhì)器官病變?yōu)樘卣鞯膿p傷與自由基生成過多、細胞內(nèi)鈣超載、中性粒細胞及補體系統(tǒng)活化、細胞凋亡異常等因素密切相關(guān)，其中氧自由基起著重要作用[3,4]。本研究顯示，實驗組家兔左腎在完全缺血40 min后恢復(fù)再灌注，經(jīng)過1.5 h后，左腎微循環(huán)中滯留的中性粒細胞和微血栓數(shù)量明顯高于對照組，表明其參與腎臟病理損傷的形成。缺血-再灌注的腎臟血管內(nèi)大量中性粒細胞的滯留可能與血管內(nèi)皮表達粘附因子增強有關(guān)，滯留的中性粒細胞激活后可產(chǎn)生大量自由基，引起血管內(nèi)皮損傷，造成血小板粘附和微血栓形成，加重腎臟的血液循環(huán)障礙和病理變化的形成。

研究證明，在缺血-再灌注損傷過程中，受損器官內(nèi)激活的中性粒細胞和血管內(nèi)皮細胞均可釋放大量的致炎因子，如溶酶體酶、自由基、蛋白酶等，不僅造成血管自身的損傷，還可引起周圍組織細胞病變[5]。本研究觀察到，實驗組家兔的左腎在再灌注后主要表現(xiàn)為腎小球血管團膨大，腎球囊狹小，腎小管上皮細胞彌漫性腫脹，腎小管腔變小、形狀不規(guī)則，腎小管上皮細胞廣泛的水泡變性和壞死，部分腎小管內(nèi)可見均質(zhì)的蛋白管型。腎小管上皮病變的形成不僅與組織缺血性缺氧有關(guān)，還可能與再灌注后局部組織內(nèi)形成的自由基對細胞生物膜的損傷和溶酶體酶對細胞結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)，這種損傷也是最終導(dǎo)致腎功能不全的重要原因。