楊 瑋，齊 艷，楊慧芬，羅 華

浙江省杭州市中醫(yī)院：1.檢驗科；2.乳腺外科，浙江杭州 310007

肉芽腫性乳腺炎(GLM)是以乳腺組織肉芽腫形成為主要病理表現(xiàn)的乳腺慢性炎癥，主要侵犯乳腺小葉，故也常稱為肉芽腫性小葉性乳腺炎。該病近年來發(fā)病率有所上升，主要在育齡期女性產(chǎn)后幾年發(fā)病，為一種慢性局灶性炎癥。有關(guān)病因?qū)W說包括自身免疫反應(yīng)或者乳汁的超敏反應(yīng)、局部創(chuàng)傷、口服避孕藥以及微生物感染，但至今其病因不明[1]。目前針對GLM患者的抗菌藥物、激素及外科手術(shù)等治療方法的效果往往有限，病情易復(fù)發(fā)，甚至根據(jù)影像學(xué)及臨床表現(xiàn)易被誤診為結(jié)核性、真菌性乳腺炎或惡性病變，給患者帶來很大的痛苦[2]。造成這些問題的部分原因是其病原菌為苛養(yǎng)菌，而常規(guī)實驗室因培養(yǎng)基營養(yǎng)條件有限無法培養(yǎng)出，或培養(yǎng)出來被忽視為皮膚定植菌，或培養(yǎng)出來因?qū)嶒灄l件有限無法鑒定，從而不能提供準(zhǔn)確的病原學(xué)證據(jù)以致誤導(dǎo)了臨床的診治。2002年以來，國外陸續(xù)有報道，GLM與感染有關(guān)，尤其是與克氏棒狀桿菌的感染有關(guān)[3-4]，而國內(nèi)文獻罕見報道。本研究旨在探討GLM患者乳腺穿刺液中分離出的親脂性棒狀桿菌的分布及對抗菌藥物的敏感性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年9月至2018年5月杭州市中醫(yī)院乳腺外科門診收治的20例GLM患者為研究對象，患者年齡16～48歲，中位年齡34歲，1例為男性，其他均為女性。患者均通過乳腺細針進行穿刺，在穿刺液標(biāo)本中分離得到20株純培養(yǎng)、不重復(fù)菌株，菌株均為常規(guī)48 h不生長，但通過延長培養(yǎng)時間至72～96 h或厭氧培養(yǎng)分離得到?；颊叽┐桃簶?biāo)本均經(jīng)病理診斷為GLM。患者相關(guān)臨床資料及病原菌鑒定結(jié)果見表1。

1.2儀器與試劑 PCR擴增儀(德國Biometra公司)；3730測序列分析儀(美國ABI公司)；基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS，德國Bruker公司)；Taq酶及PCR反應(yīng)相關(guān)試劑(日本TaKaRa公司)；血平板，1%吐溫-80血平板，1%吐溫-80血MH平板(上?？岂R嘉生物科技有限公司)；E-test藥敏條(溫州市康泰生物科技有限公司)；厭氧發(fā)生袋(法國生物梅里埃公司)。

1.3方法

1.3.1質(zhì)譜分子鑒定及16S rRNA測序分析 20株菌株經(jīng)1%吐溫-80血平板轉(zhuǎn)種培養(yǎng)48 h后，進行MALDI-TOF-MS菌種鑒定，同時對提取的總DNA進行16S rRNA通用基因27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，正向引物)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，反向引物)序列的擴增。在20.0 μL的PCR反應(yīng)體系中含有10×PCR Buffer(2.5 mmol/L，含MgCl2)2.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.6 μL，引物量為8.0 pmol，Taq(5 U/μL)0.1 μL，加入約50.0 ng的模板DNA，其余體積以無菌超純水補足。PCR擴增反應(yīng)過程：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次，最后再72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物。序列PCR擴增、凝膠電泳擴增產(chǎn)物及對擴增產(chǎn)物進行測序，再通過GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，分析菌種名稱。

1.3.2藥敏試驗 菌株經(jīng)1%吐溫-80血平板、35 ℃、5%CO2復(fù)活培養(yǎng)48 h后，制備0.5麥?zhǔn)蠞岫刃迈r菌液，用纖維聚酯棉簽均勻涂布3遍至1%吐溫-80血MH平板上，按照E-test藥物塑脂條廠家說明進行藥敏貼條，置于35 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后讀取最低抑菌濃度(MIC)值，根據(jù)歐洲藥敏試驗委員會(EUCAST)標(biāo)準(zhǔn)進行敏感性判讀。

1.3.3親脂性試驗 菌株同時轉(zhuǎn)種血平板和1%吐溫-80血平板，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，肉眼觀察平板上單個菌落生長情況。如果1%吐溫-80血平板菌落直徑比一般血平板大，即判為親脂性試驗陽性。

1.4相關(guān)指標(biāo)定義 LogP系數(shù)是辛醇的化合物濃度與水中濃度的比值，是親油性量度的分布系數(shù)，具有高LogP系數(shù)的抗菌劑優(yōu)先分配給親油性組織，正數(shù)為親脂性，負(fù)數(shù)為親水性。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)譜分子鑒定及16S rRNA測序分析 GLM患者乳腺穿刺液分離到的20株菌株經(jīng)過質(zhì)譜分子鑒定及16S rRNA測序分析鑒定，有19株結(jié)果一致，其中16株均為克氏棒狀桿菌，1株為結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌，2株為厭氧菌，分別為黑爾嗜胨菌和貪婪丙酸桿菌。MALDI-TOF-MS與16S rRNA測序結(jié)果高度一致，準(zhǔn)確性達95%(19/20)。見表1。

2.2藥敏試驗 除1株結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌(M9)對所有受試的12種抗菌藥物均表現(xiàn)為高度敏感外，其余17株棒狀桿菌的藥敏表型基本相同。根據(jù)2011年歐洲藥敏試驗委員會(EUCAST)標(biāo)準(zhǔn)進行敏感性判讀，17株棒狀桿菌對青霉素(P)、氨芐西林/舒巴坦(SAM)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢曲松(CRO)、米諾環(huán)素(MH)、利奈唑胺(LZD)、萬古霉素(VA)均敏感，而對紅霉素(E)、克林霉素(DA)MIC值大于32.000 μg/mL，耐藥率均達到94.4%。部分菌株對左氧氟沙星(LEV)和四環(huán)素(TE)高度耐藥，耐藥率分別為22.2%、27.7%。結(jié)合藥物L(fēng)og P系數(shù)綜合分析，對于由親脂棒狀桿菌引起的非哺乳期GLM的感染，建議選擇脂肪組織分布較好的LZD、復(fù)方磺胺甲噁唑(SXT)、P等進行規(guī)范治療。P、SAM、CXM、CRO、SXT、TE、DA、LZD、VA的LogP系數(shù)分別為0.76、-2.3/-1.5、-2.3、-1.8、1.28/0.79、-3.5、1.04、0.64、-4.4。其余抗菌藥物的LogP系數(shù)在相關(guān)文獻中未查到。見表2。

表1 20例GLM患者臨床資料及乳腺穿刺液標(biāo)本的病原菌鑒定

表2 18株棒狀桿菌對抗菌藥物的MIC(μg/mL)

續(xù)表2 18株棒狀桿菌抗菌藥物的MIC(μg/mL)

2.3親脂性試驗 結(jié)果顯示，16株克氏棒狀桿菌及2株其他種棒狀桿菌親脂性試驗結(jié)果為強陽性，2株厭氧菌延長培養(yǎng)時間后也具有一定的親脂性。

3 討 論

非哺乳期乳腺炎的病原菌構(gòu)成較為復(fù)雜[5]，其診治相對比較困難，主要依靠臨床表現(xiàn)、B超、病理檢查、微生物培養(yǎng)。本研究對GLM患者的乳腺穿刺液培養(yǎng)48 h后報告陰性的標(biāo)本通過延長培養(yǎng)時間及改變培養(yǎng)條件，共分離到罕見菌20株，其中16株均為克氏棒狀桿菌，2株為結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌，2株為厭氧菌，體外試驗提示所有棒狀桿菌均表現(xiàn)了較好的親脂性，這些均提示了克氏棒狀桿菌等親脂性革蘭陽性菌在非哺乳期GLM中具有重要價值。由于乳腺組織具有富脂性，而常用抗菌藥物多為親水性，從而導(dǎo)致常規(guī)抗菌治療療效有限并易復(fù)發(fā)。本研究通過體外試驗篩選出親脂性較好且敏感性高的抗菌藥物，從而可以指導(dǎo)臨床進行合理使用。

克氏棒狀桿菌是一種少見的革蘭陽性親脂性棒狀桿菌，因該菌缺乏特征性的分支酸而在常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后難以生長，該菌在GLM的發(fā)病過程中具有重要作用，國外已有相關(guān)報道[3-4]。本研究分離得到的棒狀桿菌均來自GLM患者的乳腺穿刺液且為純培養(yǎng)，有3株菌株分別在其來源宿主中多次反復(fù)分離到，并且在大部分不同患者中均分離出同一種菌。由此可見，克氏棒狀桿菌在GLM臨床診斷中具有重要價值。因為克氏棒狀桿菌具有親脂性，也可見其在血液、心臟瓣膜、導(dǎo)管出口等富含脂肪組織部位感染的病例報道[6]。然而，目前大多數(shù)實驗室對于常規(guī)培養(yǎng)基48 h不生長或者生長不良的菌株，或者生長出來但對其致病性不了解，常將其作為污染菌處理。同時，因目前使用的法國生物梅里埃API、VITEK2，美國BD公司的Phonix等生化鑒定系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫目錄中尚缺乏該菌名稱從而導(dǎo)致常規(guī)實驗室無法培養(yǎng)及鑒定出該菌。本研究證實MALDI-TOF-MS分析結(jié)果與16S rRNA測序結(jié)果高度一致，準(zhǔn)確性可達95%，提示常規(guī)實驗室應(yīng)積極采用質(zhì)譜儀才能準(zhǔn)確進行菌種鑒定。鑒于該菌在GLM中的重要意義，進一步研發(fā)基于特異性免疫乳膠凝集或PCR探針等技術(shù)的快速診斷試劑盒，將有助于常規(guī)實驗室對克氏棒狀桿菌的快速篩查。此外，本研究中也分離到2株結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌，親脂性試驗也為陽性，說明其在GLM中也具有一定的價值，與國外病例報道一致[7]。另外對于M6菌株兩種試驗方法重復(fù)鑒定結(jié)果不完全一致，可能與菌株本身特性或?qū)嶒灱夹g(shù)有關(guān)，仍需進一步研究證實。

此外，本研究純培養(yǎng)分離到2株乳腺來源的厭氧菌，目前國內(nèi)外報道少見，分別為菌株A1黑爾嗜胨菌和A2貪婪丙酸桿菌，親脂性試驗也為陽性。黑爾嗜胨菌是少見的革蘭陽性厭氧球菌，實驗室易誤鑒定為不解糖嗜胨菌，但其獨立引起乳腺炎罕見報道[8]。貪婪丙酸桿菌一般定植在人體皮脂腺豐富部位，是一種生長緩慢、低毒力但易被臨床忽視的革蘭陽性厭氧桿菌，該菌具有一種特殊的類似胞外聚合物的結(jié)構(gòu)，有助于形成生物膜，抵抗免疫清除作用，最終導(dǎo)致慢性的頑固感染[9]。目前國外有乳腺外科手術(shù)后發(fā)生慢性化膿性感染的個案報道[10-11]，本研究的唯一男性GLM患者臨床情況與楊曉芳等[12]報道相似。因此，臨床微生物實驗室要重視乳腺膿液中厭氧菌的培養(yǎng)，降低漏檢率，更好地指導(dǎo)臨床診治。

此外，本研究通過提高培養(yǎng)基脂質(zhì)成分，可使親脂棒桿狀菌培養(yǎng)48 h后生長良好，提示針對乳腺等富含脂肪組織部位病原菌的分離建議使用富脂性平板，將會極大提高特殊親脂性微生物的檢出率。本研究使用的1%吐溫-80血平板，在培養(yǎng)后平板因吐溫的脂溶性往往促進羊血溶血。因此，添加富脂奶制品等優(yōu)化培養(yǎng)基的研發(fā)正在進行中。

本研究中棒狀桿菌的體外藥敏試驗結(jié)果顯示，除E、DA整體表現(xiàn)為高度耐藥及部分菌株對LEV高度耐藥外，其他藥物均表現(xiàn)較低的MIC。M9菌株為結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌，其體外藥敏試驗表現(xiàn)為高度敏感，與國外報道不同[7,13]。然而目前針對GLM的抗菌藥物治療效果不佳，可能原因如下：導(dǎo)致乳腺感染的病原菌多為富脂性，而臨床常用藥往往為水溶性抗菌藥物。本研究中18株親脂性棒狀桿菌對親脂性較高的DA卻表現(xiàn)為高度耐藥，因此建議使用Log P系數(shù)尚可且MIC非常穩(wěn)定的LZD，與國外治療成功的案例報道一致[14]。