李 喬，廖艷婷，孫愛農(nóng)

廣東省中山市中心血站檢驗科，廣東中山 528400

MNS血型系統(tǒng)是繼ABO血型系統(tǒng)后的第二大血型系統(tǒng)，其抗原和基因具有高度多態(tài)性且非常復(fù)雜，產(chǎn)生的抗原表型在不同的地區(qū)、種族中特異性明顯。M抗原與Mur抗原屬于MNS血型系統(tǒng)48個抗原之一，被國際輸血協(xié)會(ISBT)分別命名為MNS1和MNS10[1]。在我國與Mur抗原相關(guān)的表型以GP.Mur最為常見[2]，其對應(yīng)的抗體能夠引起較嚴(yán)重的同種異體性免疫反應(yīng)，如溶血性輸血反應(yīng)[3]、新生兒溶血病[4-5]和配血困難[6]等。因此，血型抗原的準(zhǔn)確定型對輸血安全和疾病預(yù)防有著重要的臨床意義。目前關(guān)于M抗原與Mur抗原二者相關(guān)性的研究較少，本次試驗主要探討了M抗原與Mur血型的關(guān)聯(lián)性及抗-M檢測的影響因素，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機選取本站2020年7-8月581例獻血者，其中男性占53%(309/581),中位年齡37歲。所有獻血者采集5 mL EDTA-K2抗凝靜脈血，4 ℃儲存并在4 d內(nèi)完成檢測。從既往收集的獻血者抗-M陽性血漿標(biāo)本中選取不同抗體水平(效價)各3份，均屬于IgM型。

1.2儀器與試劑 96孔U型底微量板(蘇州康容生物醫(yī)療科技有限公司，批號：20191203)；全自動加樣儀為瑞士哈密爾頓公司STAR-8CH型；常規(guī)離心機為日本久保田KA-2200和4200型(平板)；振蕩儀為德國海德姆Titramax101型。單特異性抗-Mur試劑(批號M090622)來自本站制備的人源AB型抗-Mur，屬于IgM/IgG混合性抗體[7]；單克隆抗-M來源于A、B、C 3個廠家(廠家A，批號：OMM157-1；廠家B，批號：020519C；廠家C，批號：20200324)；單克隆抗-N(廠家A，批號：ONM233-1)；抗體篩選紅細(xì)胞來源于C、D兩個廠家(廠家C，批號：20207013；廠家D，批號：20200407)。木瓜酶粉劑和IgG抗-D試劑(均為上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號：20190718和20190826)，1%木瓜酶應(yīng)用液由本站配制。

1.3方法

1.3.1M/Mur抗原或抗體檢測方法 微孔板鹽水法：30 μL樣本血漿或抗體試劑與20 μL 4%試劑或樣本紅細(xì)胞混合，振蕩儀4 檔(500 r/min)混勻30 s后，室溫(24 ℃，下同)孵育15 min，期間不能震蕩，200×g離心1 min，3 min內(nèi)觀察結(jié)果，出現(xiàn)凝集者為陽性反應(yīng)，反之為陰性。試管鹽水法參照文獻[8]操作。

1.3.2兩步酶法(試管法) 將1%木瓜酶稀釋液分別與M/Mur抗原陽性的獻血者紅細(xì)胞等量混合，37 ℃孵育30 min，洗滌3次紅細(xì)胞，用生理鹽水配成4%酶處理后的紅細(xì)胞懸液。將酶處理后的紅細(xì)胞分別與人源性抗-M、陽性對照(IgG抗-D)、陰性對照(生理鹽水)各50 μL混合，37 ℃水浴30 min，1 000×g離心15 s，觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1廣東中山地區(qū)獻血者M和Mur血型頻率 選取581例獻血者標(biāo)本，分別進行M和Mur血型鑒定，其中M抗原陽性453例占78.0%(453/581)，Mur抗原陽性46例占7.9%(46/581)。

2.2M抗原與Mur抗原的關(guān)聯(lián)性 將2.1篩得的46例Mur抗原陽性標(biāo)本用單克隆抗-M試劑進行檢測，結(jié)果顯示M抗原均為陽性，Mur抗原中M抗原陽性者的發(fā)生頻率為100.0%(46/46)。

2.3不同條件對人源性抗-M檢測敏感性的影響

2.3.1溫度對人源性抗-M的影響 采用試管鹽水法對3例人源性抗-M進行效價檢測，結(jié)果顯示，孵育溫度越低，人源性抗-M活性越高。見表1。

表1 不同溫度下抗-M效價檢測結(jié)果

2.3.2孵育時間對人源性抗-M的影響 室溫條件下，觀察不同孵育時間試管鹽水法中3例人源性抗-M的效價，結(jié)果表明該方法中最佳孵育時間是15 min。見表2。

表2 不同孵育時間抗-M效價檢測結(jié)果

2.3.3不同廠家試劑紅細(xì)胞對人源性抗-M的影響 室溫條件下，紅細(xì)胞越新鮮，敏感性更高。純合子(MM型)紅細(xì)胞與人源性抗-M反應(yīng)敏感性更強，不同廠家之間試劑的紅細(xì)胞質(zhì)量存在差異性，D廠家篩選紅細(xì)胞的M抗原性強。見表3。

2.4不同廠家單克隆抗-M試劑比較

2.4.1不同溫度對試劑敏感性的影響 試驗結(jié)果顯示，試劑孵育最佳溫度為4 ℃和24 ℃。見表4。

2.4.2不同孵育時間對試劑敏感性的影響 試驗結(jié)果顯示，室溫下，試劑最佳孵育時間是15 min。見表5。

2.5木瓜酶對M類抗體的影響 經(jīng)木瓜酶處理后的M/Mur抗原陽性紅細(xì)胞，與人源性抗-M和抗-Mur無凝集，與陽性對照(IgG抗-D)出現(xiàn)凝集，與陰性對照(生理鹽水)無凝集反應(yīng)。

表3 不同廠家試劑紅細(xì)胞對人源性抗-M的效價結(jié)果

表4 不同溫度下單克隆抗-M效價檢測結(jié)果

表5 不同孵育時間下單克隆抗-M效價檢測結(jié)果

3 討 論

MNS血型抗原決定簇位于紅細(xì)胞膜上的血型糖蛋白A和血型糖蛋白B上，并由相鄰的GYPA和GYPB基因進行編碼。M抗原是被鑒定的第1個MNS系統(tǒng)抗原，其決定簇存在于血型糖蛋白A上，由GYPA基因編碼。Mur抗原屬于MNS系統(tǒng)中的Miltenberger(簡稱Mi)亞系列抗原，表達(dá)在GP.Mur、GP.Hop、GP.Bun、GP.Dane表型紅細(xì)胞上。GP.Mur編碼基因?qū)儆贕YP(B-A-B)雜交基因，由GYPB基因假外顯子3的部分片段被GYPA基因的相應(yīng)片段所取代而形成[1]。因此，M抗原與Mur抗原二者關(guān)系密不可分，多數(shù)情況下應(yīng)為同時表達(dá)。

本研究中，Mur抗原者中M抗原陽性的發(fā)生頻率為100.0%(46/46)，其中僅有1例Mur抗原陽性而初篩M抗原為陰性、復(fù)查后變陽性的標(biāo)本，疑為抗原凝集強度較弱導(dǎo)致了初篩M抗原的誤判，經(jīng)過不同廠家的抗-M血清再次復(fù)核后為M抗原陽性。有研究報道，中國人群中Mur抗原陽性而M抗原陰性的發(fā)生率為13.45%(16/119)[9]，亞裔美國人則為2.06%(2/97)[10]，本研究結(jié)果為0(0/46)，與文獻數(shù)據(jù)不一致，今后還需要進一步分析原因。

抗-M以天然產(chǎn)生的IgM類抗體較多，為低溫冷抗體，多在輸血、妊娠和細(xì)菌感染等情況刺激下產(chǎn)生，并激活補體，可引起體內(nèi)抗原陽性紅細(xì)胞出現(xiàn)溶血反應(yīng)。在結(jié)果2.3試驗中，低濃度抗體若孵育時間不足易導(dǎo)致漏檢，而為加強抗原抗體反應(yīng)性本研究延長孵育時間至30 min，但效果并不明顯，因此孵育時間以15 min、溫度以4 ℃為最佳。試劑紅細(xì)胞新鮮程度、廠家篩選紅細(xì)胞試劑質(zhì)量對抗原抗體反應(yīng)的效價強度有一定的影響，即臨近有效期的試劑有造成人源性抗-M漏檢的可能，日常篩選試驗中也應(yīng)考慮這一點。紅細(xì)胞膜上抗原表達(dá)純合子(雙劑量)要比雜合子(單劑量)更多，因此在與抗-M反應(yīng)時，純合子(MM型)紅細(xì)胞比雜合子(MN型)紅細(xì)胞反應(yīng)效價更強，即“劑量效應(yīng)”現(xiàn)象[11]。經(jīng)木瓜酶處理后，紅細(xì)胞中的MNS、Mia和Mur抗原結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致抗原抗體反應(yīng)減弱或消失[1]。本試驗結(jié)果與文獻[12]報道的MNS血型系統(tǒng)的特性是一致的。

目前M血型檢測主要依靠單克隆抗-M試劑，但結(jié)果2.4顯示，單克隆抗-M試劑在不同條件下，對抗-M的敏感性存在差異。應(yīng)盡可能選擇抗體效價高的抗-M試劑。立即離心法或孵育15 min時需要抗-M效價達(dá)到1∶16，因為抗-M水平過低會導(dǎo)致M血型的漏檢或誤判。有研究報道，M抗原發(fā)生頻率在深圳和溫州分別為71.2%(685/962)[13]和78.4%(527/672)[14]，Mur抗原發(fā)生頻率在廣州和香港分別為9.7%(51/528)[2]和6.3%(392/6 241)[15]，本研究中M抗原和Mur抗原發(fā)生頻率為78.0%和7.9%，符合該抗原在中國人群中發(fā)生頻率的特點。

為防止漏檢抗-M/抗-Mur類不規(guī)則抗體，應(yīng)盡可能選擇近期(距生產(chǎn)日期2個月內(nèi))或M血型為純合子(若同時有Mur陽性更佳)的不規(guī)則抗體篩選紅細(xì)胞，在出現(xiàn)疑難配血的情況下，應(yīng)充分排除試劑、人員操作以及反應(yīng)時間等影響因素。對于存在抗-M/抗-Mur的臨床患者應(yīng)提供M/Mur抗原陰性的同型輸注，以提高輸血質(zhì)量和治療效果，并減少輸血不良反應(yīng)的發(fā)生率。