秦義嫻，劉 丹，高金源，周飛燕，吳華偉*

(1. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081； 2. 武漢科前生物股份有限公司，武漢 430070)

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以母豬繁殖障礙和各日齡豬只呼吸道疾病為特征的病毒性傳染病[1]。該病自1987年在北美首次報道以來[2]，已蔓延至大部分國家和地區(qū)，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成極大經(jīng)濟損失，我國也不例外。

PRRSV屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長約15 kb，包含10個開放閱讀框(ORFs)，其中ORF5、ORF6和ORF7分別編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5、M和N[3]。GP5蛋白作為病毒的主要糖基化結(jié)構(gòu)蛋白，具有較好的免疫原性，能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體，而且其誘導的抗體中和能力強于GP4誘導產(chǎn)生的抗體[4-5]。GP5與M蛋白可形成GP5/M異源二聚體，對病毒裝配起重要作用，并介導病毒吸附宿主細胞過程[6-7]。此外GP5蛋白又是PRRSV變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白，基因1型與2型間GP5的氨基酸序列相似性為52%～57%，同型毒株間氨基酸序列相似性為88%～99%[8-9]。這些都使得GP5蛋白成為發(fā)展新型疫苗和診斷試劑的良好候選蛋白。本研究以原核表達系統(tǒng)成功表達了NADC30-like毒株P(guān)RRSV 46D的GP5蛋白，并對其進行鑒定與純化，以期為下一步GP5單克隆抗體的制備奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株、表達載體 Marc-145細胞、PRRSV 46D(NADC30-like毒株)、pCold-TF表達載體，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.2 主要試劑 Rossetta (DE3)、Top10感受態(tài)細胞購于博邁德生物；病毒RNA提取試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒購于北京天根生物公司；BamH I、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、KOD酶高保真PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、Protein Marker購于TaKaRa公司；DNA純化回收試劑盒購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；pEasy-Blunt Simple Cloning Kit購于北京全式金公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；PRRSV陽性血清由實驗室保存；HRP標記的兔抗豬IgG為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 ORF5基因原核表達載體的構(gòu)建及表達

1.3.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的PRRSV NADC30-like毒株序列設(shè)計一對針對ORF5基因的特異性引物，上游引物ORF5-F為5’-ATGTTGGGGAAGTGCTTGAC-3’，下游引物ORF5-R為5’-CTAGAGATGACCCATCGTT-3’，預(yù)期擴增長度為603 bp。在上下游引物上分別添加BamH I和Hind III酶切位點，即5’-CGGGATCCATGTTGGGGAAGTGCTTGAC-3’和5’-CCAAGCTTCTAGAGATGACCCATCGTT-3’，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司(后簡稱華大基因)合成。

1.3.2 ORF5基因的克隆及序列測定 按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取PRRSV 46D毒株的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以KOD高保真酶進行PCR擴增，回收目的片段后與pEasy-Blunt Cloning 載體連接，轉(zhuǎn)化入Top10感受態(tài)細胞，挑取菌落于2 mL LB培養(yǎng)液中37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，進行PCR鑒定，取鑒定正確的菌液送華大基因測序。將測序正確的菌液保菌并提取質(zhì)粒，質(zhì)粒命名為pEasy-Blunt-GP5。

1.3.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以pEasy-Blunt-GP5質(zhì)粒為模板，應(yīng)用含酶切位點的引物和KOD高保真酶進行PCR擴增，回收含酶切位點的目的片段。與pCold-TF原核表達載體同時進行BamH I/Hind III雙酶切，回收后進行連接，連接體系為：載體2 μL，目的片段6 μL，10×T4 Buffer 1 μL，T4 DNA連接酶1 μL。16 ℃，連接1 h。轉(zhuǎn)化，挑取菌落，于5 mL LB培養(yǎng)液中37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，小提質(zhì)粒，將質(zhì)粒命名為pCold-TF-GP5。將重組質(zhì)粒按照下述體系進行雙酶切：質(zhì)粒3 μL，10×Cusamart Buffer 1 μL，BamH I/Hind III各0.5 μL，ddH2O 5 μL。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒送華大基因測序。

1.3.4 重組質(zhì)粒的誘導表達 將測序正確的重組質(zhì)粒0.5 μL轉(zhuǎn)化100 μL Rosetta DE3感受態(tài)細胞，挑菌于2 mL含100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)液中37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，獲得種子菌。按1∶100(V/V)接種于3 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)至OD=0.6，加入IPTG(1 mmol/L)誘導，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)4 h。

1.4 PRRSV GP5重組蛋白的鑒定

1.4.1 SDS-PAGE 取1 mL誘導的菌液，12000 r/min，離心2 min，棄上清，沉淀用100 μL PBS(1/15 mol/L，pH7.2)吹散，加入25 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10 min，12000 r/min離心2 min，取上清進行SDS-PAGE檢測，同時設(shè)置空載體對照及未誘導對照。

1.4.2 Western blot 按1.4.1方法進行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至 0.45 μm PVDF膜，PBST洗滌3次，加入5%W/VPBST脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入1∶100稀釋的PRRSV陽性血清室溫孵育1 h。PBST洗滌5次。加入1∶10000稀釋的HRP標記的兔抗豬IgG室溫孵育1 h。PBST洗滌5次。依照DAB顯色試劑盒操作說明，進行避光顯色，流水終止顯色。

1.5 重組蛋白的大量表達及表達形式的檢測 接2 μL活化的菌液到20 mL LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min 37 ℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到1000 mL LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min 37 ℃培養(yǎng)至OD=0.6，IPTG(0.5 mmol/L)16 ℃誘導過夜。6000 r/min，離心5 min，棄上清。菌體用30 mL 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散，超聲波破碎(500 W，60次，每次10 s，間隔15 s)。取100 μL超聲后的菌懸液，12000 r/min離心10 min，取50 μL上清至另一EP管，上清去除干凈后沉淀用50 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散。SDS-PAGE電泳檢測表達形式。

1.6 重組蛋白的純化 用去離子水洗鎳柱，至pH7.0。掛鎳，至pH 2～3。用去離子水洗柱至pH7.0。用100 mL 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液平衡鎳柱。用50 mL含0.5 mol/L氯化鈉的10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)8 mol/L尿素的溶液平衡鎳柱。稀釋樣品，使樣品含氯化鈉終濃度為0.5 mol/L，上樣。上樣結(jié)束后，用含0.5 mol/L氯化鈉的10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液洗柱。分別用含15 mmol/L咪唑、60 mmol/L咪唑、300 mmol/L咪唑的10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0，含0.5 mol/L氯化鈉)溶液洗脫，分別收集蛋白峰。SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORF5基因的擴增、克隆及序列測定 應(yīng)用設(shè)計的特異性引物ORF5-F和ORF5-R對PRRSV 46D毒株進行PCR擴增，得到一條長度約為603 bp的目的條帶(圖1)，與預(yù)期片段大小一致。將目的片段克隆至pEasy-Blunt Cloning載體后測序得到該基因的正確序列。

M. DNA標準DL2000;1.陰性對照；2.PCR產(chǎn)物M. DNA Marker DL 2000; 1. Negative control; 2. PCR products圖1 PRRSV ORF5基因的PCR擴增Fig 1 PCR amplificaiton of PRRSV ORF5 gene

2.2 重組質(zhì)粒pCold-TF-GP5的雙酶切鑒定 對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCold-TF-GP5進行雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，大小5769 bp左右的條帶為切開的載體片段，大小619 bp左右的條帶是目的片段(圖2)。

M. DNA標準DL5000; 1. pCold-TF 空載體;2. pCold-TF-GP5重組質(zhì)粒M. DNA Marker DL 2000; 1. pCold-TF control;2. pCold-TF-GP5 recombinant plasmid圖2 重組質(zhì)粒pCold-TF-GP5的雙酶切鑒定Fig 2 Identification of recombinant plasmid pCold-TF-GP5 by double enzyme digestion

2.3 pCold-TF-GP5重組蛋白的SDS-PAGE分析 取1 mL誘導表達的菌液進行SDS-PAGE，結(jié)果在72 ku處可見表達條帶，與預(yù)期蛋白大小一致(圖3)。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.pCold-TF空載體；2.pCold-TF-GP5未誘導；3.pCold-TF-GP5誘導M. Protein molecular weight Marker; 1. pCold-TF control;2. pCold-TF-GP5 no induced; 3. pCold-TF-GP5 induced.圖3 pCold-TF-GP5重組蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig 3 SDS-PAGE identification of pCold-TF-GP5 recombinant proteins

2.4 pCold-TF-GP5重組蛋白的Western blot分析 DAB顯色后，在72 ku處有特異性條帶，而空載體對照無此特異性反應(yīng)。證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒在大腸桿菌表達系統(tǒng)中能夠準確表達(圖4)。

M. 蛋白分子質(zhì)量標準；1. pCold-TF空載體；2. pCold-TF-GP5誘導M. Protein molecular weight Marker;1. pCold-TF control; 2. pCold-TF-GP5 induced圖4 pCold-TF-GP5重組蛋白的Western blot鑒定Fig 4 Western blot identification of pCold-TF-GP5 recombinant proteins

2.5 pCold-TF-GP5重組蛋白表達形式的檢測超聲裂解誘導后的菌液，將菌液上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳，表達的GP5蛋白主要出現(xiàn)在上清中，提示該蛋白在上清中表達(圖5)。

M. 蛋白分子質(zhì)量標準；1. 超聲后全菌；2. 超聲后上清；3. 超聲后沉淀M. Protein molecular weight Marker; 1. Total bacteria after ultrasound;2. Ultrasound supernatant; 3. Precipitation after ultrasound圖5 pCold-TF-GP5重組蛋白表達形式的SDA-PAGE檢測Fig 5 Detection of expression of pCold-TF-GP5 recombinant protein by SDS-PAGE

2.6 pCold-TF-GP5重組蛋白的純化 將表達蛋白掛鎳柱后用不同濃度的咪唑(15 mmol/L、60 mmol/L、300 mmol/L)洗脫，分別收集蛋白峰，進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示咪唑洗脫的最佳濃度為300 mmol/L。最終獲得純度較高的GP5重組蛋白，濃度為0.5 mg/mL(圖6)。

M：蛋白分子質(zhì)量標準；1. 蛋白原樣；2：流穿；3：15 mmol/L 咪唑洗脫；4：60 mmol/L 咪唑洗脫；5-7：300 mmol/L 咪唑洗脫；8：0.5 mg/mL BSA; 9：1 mg/mL BSAM：Protein molecular weight Marker; 1：Original protein;2：Flow through; 3：15 mmol/L imidazole elution；4：60 mmol/L imidazole elution；5-7: 300 mmol/L imidazole elution；8: 0.5 mg/mL BSA; 9: 1 mg/mL BSA圖6 pCold-TF-GP5重組蛋白的純化Fig 6 Purification of pCold-TF-GP5 recombinant protein

3 討論與結(jié)論

自1996年由郭寶清等首次從我國疑似PRRS病例中分離到PRRSV以來[10]，該病已在我國存在二十余年，成為影響我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，特別是2006年高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的出現(xiàn)及2013年以來NADC30-like毒株在我國的逐步流行，使得PRRSV流行形勢越來越復雜，這些都給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來前所未有的挑戰(zhàn)。目前，預(yù)防PRRS主要的疫苗是弱毒苗和滅活苗，兩種疫苗各有優(yōu)缺點，保護效果有限，越來越多的學者試圖研究新型基因工程疫苗，而GP5蛋白因其良好的免疫原性及較強的中和活性，已成為優(yōu)秀的候選蛋白。

表達GP5蛋白常采用原核表達和真核表達兩種方式，白晶等[11]擴增出ORF5基因后將其克隆至真核表達載體pCI-neo并轉(zhuǎn)染Marc-145細胞，成功表達出目的蛋白；李志杰等[12]則將ORF5基因克隆至pCDNA3.1(+)真核表達載體，轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后獲得目的蛋白的正確表達。相比于真核表達，原核表達具有操作簡單、經(jīng)濟快捷、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，且經(jīng)原核表達的GP5蛋白仍具有免疫原性。因GP5蛋白含有31個氨基酸信號肽和3個跨膜功能區(qū)[13]，如果將ORF5基因全長克隆至原核表達載體，蛋白表達難度較大，故目前的研究中，原核表達時構(gòu)建GP5重組質(zhì)粒的策略通常是將信號肽刪除或?qū)⒉糠挚缒^(qū)去掉[14-15]，但這樣可能會對表達蛋白的抗原性產(chǎn)生影響，也不利于抗原表位的鑒定。本研究以pCold-TF為載體，轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)表達菌，充分利用了pCold-TF作為冷休克載體可高效可溶性表達其他系統(tǒng)中難以表達蛋白的優(yōu)點及Rosetta(DE3)可提供稀有密碼子的特點，成功獲得了表達PRRSV ORF5基因全長的可溶性蛋白，為下一步制備針對GP5蛋白的單克隆抗體提供了物質(zhì)保障。