華伊，張正一，黃莉莉，王艷艷，葉曉楠，李廷利

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗(ZiziphusjujubaMill.var.spinosae(Bunge)Hu ex H.F.Chou)的干燥成熟種子，主治虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗等癥[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁具有一定的抗?fàn)顟B(tài)性焦慮作用[2-3]，酸棗仁在臨床的應(yīng)用普遍使用炒制品。狀態(tài)性焦慮指機(jī)體面對某一特定情境而產(chǎn)生的暫時的緊張不安的情緒狀態(tài)，曠場實驗是一種被廣泛應(yīng)用的狀態(tài)性焦慮動物模型建立及行為學(xué)評價方法[4-5]。在腦科學(xué)領(lǐng)域，杏仁核(Amygdala)被普遍認(rèn)為是情緒調(diào)節(jié)尤其是焦慮、恐懼等負(fù)性情緒調(diào)節(jié)過程中的最關(guān)鍵腦區(qū)[6-7]，杏仁核的基底外側(cè)核團(tuán)(Basolateral amygdala，BLA)是進(jìn)行焦慮處理時接收外界刺激傳入的主要部位[8]。目前為止，炒酸棗仁的抗?fàn)顟B(tài)性焦慮作用在神經(jīng)元在體電活動方面的機(jī)制尚未清晰?；谝陨希疚睦脮鐖鰧嶒灧椒ê驮隗w多通道神經(jīng)同步記錄技術(shù)，擬考察炒酸棗仁水煎液對狀態(tài)性焦慮大鼠的曠場行為學(xué)及BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼的影響，探討炒酸棗仁對狀態(tài)性焦慮的干預(yù)作用及神經(jīng)電生理方面的作用機(jī)理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(220±20)g，無特定病原體(SPF)級，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實驗動物中心，許可證號：SCXK(黑)2013-004。

動物飼養(yǎng)與監(jiān)測環(huán)境維持為通風(fēng)、避光、隔音、電磁屏蔽狀態(tài)，并通過光控定時開關(guān)程序進(jìn)行12 h/12 h明暗交替光照處理，室內(nèi)溫度：20～24 ℃，相對濕度：50%～60%，噪聲≤40 dB。

1.2 實驗藥物

酸棗仁，原產(chǎn)地山西，依照文獻(xiàn)[9]方法，制備炒酸棗仁和炒酸棗仁水煎液。

1.3 實驗試劑

生理鹽水(170104D5，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司)，戊巴比妥鈉(WS20140104，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，義齒基托聚合物(170308，上海Pigeon Dental有限公司)，義齒基托樹脂(20170408，上海New Century Dental Materials有限公司)，多聚甲醛(20161130，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇(20160408，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)等。

1.4 實驗儀器

半微量分析天平(MS105/A，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，曠場實驗箱(100 cm×100 cm×40 cm，木制)，標(biāo)準(zhǔn)腦立體定位儀(51600，美國Stoelting公司)，在體多通道神經(jīng)記錄分析系統(tǒng)(OPX-32D，美國Plexon公司)，低溫冷凍組織切片機(jī)(CM1950，德國Leica公司)，強(qiáng)制對流標(biāo)準(zhǔn)型烘箱(Venticell 111，德國 MMM 集團(tuán)公司)等。

2 實驗方法

2.1 在體多通道記錄電極的埋植

選取大鼠20只，經(jīng)戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，借助腦立體定位儀，圖譜[10]，確定BLA區(qū)位置(坐標(biāo)：前囟后2.5～2.8 mm，中縫線右4.5～4.8 mm，顱骨下7.5 mm)。將16(4×4陣列)通道在體記錄微電極(鉑銥合金，電極絲外周涂有絕緣層，直徑35 μm)埋置于大鼠的BLA區(qū)域，用義齒基托樹脂將整個電極部分固定在大鼠顱頂。手術(shù)后每只大鼠單獨飼養(yǎng)恢復(fù)5 d。

2.2 動物的分組及給藥

將已植入電極并經(jīng)過術(shù)后恢復(fù)的大鼠隨機(jī)分為模型對照組與炒酸棗仁組，每組各10只。經(jīng)灌胃途徑給予炒酸棗仁組大鼠炒酸棗仁水煎液(17.5 g/kg)，模型對照組灌服相同體積的蒸餾水。

2.3 模型的制備及行為學(xué)測試

依照文獻(xiàn)[11]方法，利用曠場實驗制備大鼠狀態(tài)性焦慮模型。給藥0.5 h后，將各組大鼠放入曠場箱內(nèi)底面中心，任其自由探索，記錄并分析10 min內(nèi)大鼠在曠場環(huán)境中的行為學(xué)表現(xiàn)。測試指標(biāo)為跨格次數(shù)、站立次數(shù)、進(jìn)入中央格次數(shù)、中央格運(yùn)動時間(s)和總運(yùn)動時間(s)，并以中央格運(yùn)動時間(s)除以總運(yùn)動時間(s)計算中央格/總運(yùn)動時間(%)。

2.4 神經(jīng)元放電信號的采集

給藥0.5 h后，利用在體多通道神經(jīng)記錄分析系統(tǒng)，先記錄各組動物在日常飼養(yǎng)環(huán)境中10 min內(nèi)的神經(jīng)元基礎(chǔ)放電信號，再在進(jìn)行曠場實驗的同時記錄曠場環(huán)境中10 min內(nèi)的神經(jīng)元曠場放電信號。利用Offline Sorter軟件對采集到的神經(jīng)元放電信號進(jìn)行處理，過濾低頻放電和環(huán)境干擾放電，設(shè)置信噪比大于3的信號為所需的動作電位(Spikes)信號，運(yùn)用主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)技術(shù)對分離出的動作電位進(jìn)行聚類處理，測試指標(biāo)為神經(jīng)元動作電位的放電頻率(spikes/s)。

2.5 組織學(xué)考察

電信號采集全部結(jié)束后，各組動物顱頂在體記錄電極經(jīng)電刺激器進(jìn)行通電刺激(1 mA，10 s，5次左右)，摧毀電極末端腦組織。灌流取腦，利用腦組織冰凍切片的HE染色技術(shù)判定記錄電極是否準(zhǔn)確植入大鼠的BLA區(qū)域，偏離位置的數(shù)據(jù)不予采用。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 炒酸棗仁對狀態(tài)性焦慮大鼠行為學(xué)的影響

實驗結(jié)果表明，與模型對照組相比，炒酸棗仁組大鼠在曠場中的跨格次數(shù)、站立次數(shù)及總運(yùn)動時間無明顯變化(P>0.05)，中央格運(yùn)動時間、進(jìn)入中央格次數(shù)及中央格/總運(yùn)動時間(%)明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠曠場行為學(xué)比較

3.2 炒酸棗仁對狀態(tài)性焦慮大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼的影響

3.2.1 組織學(xué)考察

大鼠腦組織冰凍切片的HE染色結(jié)果顯示，在體多通道記錄電極準(zhǔn)確植入大鼠BLA區(qū)。切片見圖1。

注：圖A為大鼠腦立體定位圖譜所示BLA區(qū)位置；圖B為大鼠腦組織切片HE染色圖，空腔指示為記錄電極末端所處位置。圖1 記錄電極定位HE染色結(jié)果(50×)

3.2.2 大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元動作電位分類

本實驗在大鼠BLA區(qū)記錄到的神經(jīng)元動作電位波形特征為：波長較長，波峰后曲線下降緩慢。按照放電模式的不同，把在BLA區(qū)記錄到的神經(jīng)元分為Ⅰ、Ⅱ兩類(以下稱BLA區(qū)Ⅰ類神經(jīng)元為NeuronⅠ，Ⅱ類神經(jīng)元為NeuronⅡ)。NeuronⅠ的時長較長、振幅稍低，自相關(guān)圖中出現(xiàn)典型的尖峰、峰值后呈現(xiàn)非常陡的下降趨勢。NeuronⅡ的時長較短、振幅較高，自相關(guān)圖中峰值后下降較緩慢。兩類神經(jīng)元動作電位放電模式的特征圖見圖2。

注：圖A為NeuronⅠ動作電位的波形圖、放電間隔直方圖及自相關(guān)圖，圖B為NeuronⅡ動作電位的波形圖、放電間隔直方圖及自相關(guān)圖。圖2 BLA區(qū)兩類神經(jīng)元動作電位特征圖

3.2.3 炒酸棗仁對狀態(tài)性焦慮大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元動作電位放電頻率的影響

實驗結(jié)果表明，與自身的基礎(chǔ)放電頻率相比，模型對照組和炒酸棗仁組大鼠在曠場中的NeuronⅠ、NeuronⅡ動作電位放電頻率均有所增加，放電頻率直方圖見圖3。將每只大鼠的曠場放電頻率減去其基礎(chǔ)放電頻率，得出的值定義為神經(jīng)元動作電位放電頻率增加值，以此值進(jìn)行兩組大鼠在曠場中神經(jīng)元動作電位放電頻率變化的對比。實驗結(jié)果表明，與模型對照組相比，炒酸棗仁組大鼠BLA區(qū)NeuronⅠ的動作電位放電頻率增加值明顯減少(P<0.05)，NeuronⅡ的動作電位放電頻率增加值無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元動作電位放電頻率增加值比較

3.3 大鼠曠場行為學(xué)與BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼的相關(guān)性分析

實驗結(jié)果表明，大鼠在曠場中的中央格/總運(yùn)動時間(%)與BLA區(qū)NeuronⅠ的動作電位放電頻率增加值之間存在明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.614，P<0.01)，與NeuronⅡ的動作電位放電頻率增加值之間存在明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0.504，P<0.05)。見圖4。

圖4 曠場中央格/總運(yùn)動時間(%)與BLA區(qū)神經(jīng)元動作電位放電頻率增加值的相關(guān)性分析

4 討論

曠場實驗利用了嚙齒動物害怕空曠環(huán)境的天性，但又對陌生場地產(chǎn)生好奇而試圖探索的矛盾心理[12]，被廣泛應(yīng)用于狀態(tài)性焦慮動物模型的復(fù)制與評價[13-14]。本文利用曠場實驗建立大鼠狀態(tài)性焦慮模型，運(yùn)用行為學(xué)實驗方法和在體多通道神經(jīng)同步記錄技術(shù)，給予炒酸棗仁水煎液的干預(yù)，記錄并分析了炒酸棗仁對狀態(tài)性焦慮大鼠的曠場行為學(xué)及BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼的影響。

對嚙齒動物而言，曠場的中央格區(qū)域具有潛在威脅，周邊格相對安全，大鼠的焦慮程度高時會更偏向于在周邊格活動[15-16]。曠場中的跨格次數(shù)、站立次數(shù)和總運(yùn)動時間等行為學(xué)指標(biāo)可用于評價大鼠的活動性和探索行為，進(jìn)入中央格次數(shù)、中央格運(yùn)動時間及中央格/總運(yùn)動時間則指示了大鼠的焦慮水平。在行為學(xué)實驗中，給予炒酸棗仁水煎液干預(yù)后，大鼠的跨格次數(shù)、站立次數(shù)及總運(yùn)動時間有所增多，運(yùn)動性與探索行為增加，這與報道[17]相符。同時，炒酸棗仁能明顯增加大鼠的中央格運(yùn)動時間、進(jìn)入中央格次數(shù)及中央格/總運(yùn)動時間(%)，大鼠的焦慮樣行為減少，與前人研究[18]結(jié)果一致，提示炒酸棗仁能減輕曠場對大鼠造成的焦慮情緒。

注：0～10 min為大鼠在日常飼養(yǎng)環(huán)境中的基礎(chǔ)放電，10～20 min為在曠場環(huán)境中的放電。圖3 曠場對大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元動作電位放電頻率的影響

大腦對信息的處理是通過神經(jīng)元群的協(xié)同工作實現(xiàn)的，動作電位則是神經(jīng)元進(jìn)行信息傳遞的基本語言[19]。神經(jīng)元動作電位的發(fā)放具有“全或無”的特點，外界刺激信息發(fā)生改變時，動作電位的放電頻率也會發(fā)生相應(yīng)的改變。神經(jīng)元信息編碼的研究本質(zhì)上就是對神經(jīng)元動作電位的放電頻率進(jìn)行的研究，這對于探索大腦進(jìn)行各種智能行為的神經(jīng)機(jī)制、揭秘大腦對外部事件的編碼機(jī)制具有重要意義[20]。杏仁核神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的同步活動在大腦情緒功能中發(fā)揮重要的作用[4-5]。大腦進(jìn)行焦慮調(diào)節(jié)的過程中，感覺信息從丘腦和感覺皮質(zhì)傳遞到基底外側(cè)杏仁核(BLA)，然后投射到中央杏仁核，再傳遞到下丘腦和腦干結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生自主神經(jīng)等反應(yīng)[21]。焦慮發(fā)生的同時伴有杏仁核功能的改變[21-22]，焦慮反應(yīng)的增加與BLA區(qū)的異?；顒佑嘘P(guān)[23]。

我們運(yùn)用在體多通道神經(jīng)同步記錄技術(shù)，通過鉑銥合金陣列記錄微電極，監(jiān)測大鼠的在體BLA區(qū)神經(jīng)元同步電信號。本文記錄到的BLA區(qū)神經(jīng)元動作電位的波形特征為波長較長，波峰后曲線下降緩慢，與文獻(xiàn)[24]報道一致。按照發(fā)放特征的不同，將記錄到的BLA區(qū)神經(jīng)元分為NeuronⅠ與NeuronⅡ。本研究發(fā)現(xiàn)，與自身的基礎(chǔ)放電相比，各組大鼠在曠場中NeuronⅠ、NeuronⅡ的動作電位放電頻率都有所增加。這一現(xiàn)象反映了大鼠面對曠場環(huán)境時，其BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼發(fā)生了改變，與前人報道[25]一致。我們將各只實驗動物的曠場放電頻率減去其基礎(chǔ)放電頻率，得出的值定義為神經(jīng)元動作電位放電頻率增加值，以此值進(jìn)行兩組大鼠神經(jīng)元動作電位放電頻率變化的對比。結(jié)果顯示，炒酸棗仁明顯降低了大鼠BLA區(qū)NeuronⅠ的動作電位放電頻率增加值，提示炒酸棗仁通過降低BLA區(qū)NeuronⅠ的動作電位放電頻率，抑制曠場對大鼠造成的焦慮狀態(tài)。

由于曠場的中央格區(qū)域?qū)游锒源嬖跐撛谖ｋU，動物的焦慮程度越高，越不喜愛在中央格運(yùn)動，實驗動物在曠場中的中央格/總運(yùn)動時間(%)這一指標(biāo)與動物的焦慮程度呈負(fù)相關(guān)[14]。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，大鼠在曠場中的中央格/總運(yùn)動時間(%)與BLA區(qū)NeuronⅠ、NeuronⅡ的動作電位放電頻率增加值間均存在明顯的負(fù)相關(guān)，證明BLA區(qū)神經(jīng)元的活動情況確與動物的焦慮狀態(tài)密切相關(guān)，且本實驗采集到的兩類BLA區(qū)神經(jīng)元的活動性均隨焦慮程度的增加而增加。由于曠場興奮了大鼠的Ⅰ、Ⅱ兩類BLA區(qū)神經(jīng)元，進(jìn)一步證實了曠場中的大鼠處于焦慮狀態(tài)。同時我們發(fā)現(xiàn)，BLA區(qū)NeuronⅠ和NeuronⅡ均為焦慮相關(guān)神經(jīng)元，但是炒酸棗仁只降低了NeuronⅠ的動作電位放電頻率，而NeuronⅡ的放電情況無明顯變化。推測炒酸棗仁并不是對BLA區(qū)所有類型的神經(jīng)元均有干預(yù)作用，炒酸棗仁對焦慮的拮抗作用也并不是只通過某一個腦區(qū)，而是多個腦區(qū)共同作用的結(jié)果，具體原因還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，炒酸棗仁具有拮抗?fàn)顟B(tài)性焦慮的作用，其神經(jīng)電生理作用機(jī)制與降低BLA區(qū)神經(jīng)元動作電位放電頻率、改變BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼有關(guān)。本研究結(jié)果在神經(jīng)電生理層面闡述炒酸棗仁的抗?fàn)顟B(tài)性焦慮作用，進(jìn)一步明確焦慮樣行為與BLA區(qū)神經(jīng)元在體活動的關(guān)系，為焦慮相關(guān)的新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。