孫彥琳，程璧瑄，周利君，羅 昱，王 婧，萬(wàn)會(huì)花，于 超

（花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心/城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室/園林環(huán)境教育部工程研究中心/林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083）

現(xiàn)代月季（Rosa spp.）是薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa L.）重要的觀(guān)賞植物類(lèi)群。是由中國(guó)古老月季與歐洲的薔薇屬植物經(jīng)過(guò)反復(fù)雜交，于1867年之后育成的一個(gè)龐大的品種群。現(xiàn)代月季具有花型飽滿(mǎn)、花期長(zhǎng)、花色豐富、花香迷人等優(yōu)點(diǎn)，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和文化價(jià)值，是世界重要的觀(guān)賞植物[1]。

花色是觀(guān)賞植物最重要的觀(guān)賞性狀之一。對(duì)于花色表型的研究，傳統(tǒng)的研究方法是采用RHSCC（royal horticultural society color chart）或 ISCC-NBS色名表示法[2]。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，儀器測(cè)色方法逐漸普及，依靠數(shù)字化技術(shù)實(shí)現(xiàn)色彩的數(shù)量化，使對(duì)顏色的描述轉(zhuǎn)變?yōu)榭陀^(guān)的定量描述，更加精準(zhǔn)也便于交流，擴(kuò)大了新品種選育和植物置景應(yīng)用的前景[3-4]。

木本植物童期較長(zhǎng)，通常需等到月季開(kāi)花后才能對(duì)其花色進(jìn)行分辨，使得現(xiàn)代月季的育種周期延長(zhǎng)。前人通過(guò)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，月季嫩芽、嫩葉顏色較深的品種其花色往往也呈現(xiàn)出較深的顏色[5-6]，這說(shuō)明月季新葉葉色與花色存在一定的相關(guān)性。然而前人研究?jī)H停留在目視測(cè)色和對(duì)花色進(jìn)行定性分析的水平，并沒(méi)有量化數(shù)據(jù)的支撐。此外，有學(xué)者對(duì)月季花瓣中花色素種類(lèi)及其與花色的關(guān)系進(jìn)行了詳盡的研究[7-10]，但對(duì)月季新葉色素與花色關(guān)系的研究尚未有報(bào)道。

本研究測(cè)量了月季新葉的SPAD值、花青苷含量，并采用CIELab系統(tǒng)對(duì)新葉和花的顏色進(jìn)行定量描述。探究月季新葉葉色與花色的相關(guān)性，從月季早春嫩葉顏色推測(cè)開(kāi)花花色，在一定程度上解決育種中存在的育種周期長(zhǎng)、育種效率低等問(wèn)題，也可為觀(guān)賞植物的早期選擇研究提供思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以“云蒸霞蔚”（Rosa' Yunzheng Xiawei'）ד太陽(yáng)城”（R.'Sun City'）的183株F1代群體為試驗(yàn)材料，材料均種植于北京林業(yè)大學(xué)小湯山實(shí)驗(yàn)基地。所有植株生長(zhǎng)環(huán)境相同、長(zhǎng)勢(shì)一致?！霸普粝嘉怠睘楣爬显录酒贩N，“太陽(yáng)城”為現(xiàn)代月季品種，遺傳背景復(fù)雜。二者表型及抗性均有較大區(qū)別，遺傳距離遠(yuǎn)，其子代花色變異豐富，本試驗(yàn)研究對(duì)象F1代群體花色包括了白、粉、紅、橙和黃5個(gè)色系，不同色系植株新葉色間存在差異，有黃綠色、綠色、紅色和紫紅色等，是開(kāi)展花色與葉色研究的良好材料。

1.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)量

取供試植株健康新鮮、色澤均勻、無(wú)病菌無(wú)損傷、完全展開(kāi)、葉色達(dá)到較穩(wěn)定階段的成熟新葉（月季新葉葉片從折疊到完全展開(kāi)的48 h內(nèi)），部位為植株地上部分15～20 cm之間，測(cè)定SPAD值和色彩參數(shù)，葉片處理后進(jìn)行花青苷含量測(cè)定，并于盛花期測(cè)量花色數(shù)據(jù)。

1.2.1 SPAD值測(cè)定

使用TYS-A葉綠素儀對(duì)植株葉片SPAD值進(jìn)行直接測(cè)定。先將葉片擦拭干凈，選取葉片的幾何中心、葉脈兩側(cè)且占比較大的顏色區(qū)域進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)植株測(cè)量3片新葉，每個(gè)葉片測(cè)量3次，計(jì)算平均值。

1.2.2 花青苷含量測(cè)定

每株取15～20片新葉，除去葉柄，用錫箔紙包裹后編號(hào)，迅速置于液氮中，后放入-80℃低溫冰箱保存，于次日進(jìn)行花青苷含量的測(cè)定。將葉片充分研磨，用配置比例為甲醇∶水∶甲酸∶三氟乙酸=70∶27∶2∶1的浸提劑浸提樣品粉末里的花青苷，用超聲波清洗器超聲波震蕩輔助浸提并離心得到上清液，使用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)（BioMate 3S）測(cè)定花青苷含量[11]。

1.2.3 葉片色差值測(cè)定

采用國(guó)際照明委員會(huì)推出的CIELab表色系統(tǒng)，用明度L*、色相a*、色相b*、色角度h及飽和度C等變量表示色彩。其中L*值反映顏色的明亮程度，0表示黑色，100表示白色。a*值反映紅色或綠色物質(zhì)的濃度，a*＞0表示顏色偏紅，a*＜0表示顏色偏綠。b*值反映橙色或藍(lán)色物質(zhì)的濃度，b*＞0表示顏色偏橙，b*＜0表示顏色偏藍(lán)。

對(duì)色差儀（NF333）進(jìn)行黑白校準(zhǔn)后，直接測(cè)量色彩參數(shù)L*、a*、b*值，每個(gè)植株測(cè)量3片新葉，計(jì)算平均值。之后根據(jù)a*、b*計(jì)算色彩屬性指標(biāo)飽和度C∶C=（a*2+b*2）1/2，色度角h∶h=tan-1（b*/a*）。

1.2.4 花瓣色差值測(cè)定

每株采集盛花期（花被與花藥完全展開(kāi)的時(shí)期）的新鮮花瓣3～5片，使用色差儀對(duì)花瓣顏色進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定位置選取每片花瓣十字交叉的中心，取平均值代表單個(gè)植株的花瓣色差值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)使用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合與篩選，制表并且進(jìn)行顯著性水平方差分析。使用SPSS 25軟件對(duì)月季新葉參數(shù)和花色參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析并計(jì)算回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1代植株新葉SPAD值、花青苷含量與色彩表型分布

F1代植株新葉SPAD值范圍為7.5～38.6，花青苷相對(duì)含量的范圍為0.14～3.37 μg/mg，新葉葉色隨著a*值從負(fù)值到正值的增大呈綠色-黃綠-紅色-紫紅色的變化。由圖1可知，a*值與新葉L*值、b*值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，a*與b*的線(xiàn)性回歸方程為y=-0.703 5x+17.452（R2=0.63），a*與 L*的線(xiàn)性回歸方程為 y=-0.502 8x+34.186（R2=0.63）。

圖1 作圖群體葉色表型分布Figure 1 Leaf color distribution of the segregating population

2.2 F1代植株花色表型分布

本試驗(yàn)采用于超[12]的分類(lèi)方法，將F1代植株分為5個(gè)色系：紅色系、粉色系、橙色系、黃色系、白色系。根據(jù)CIELab空間表色系統(tǒng)對(duì)F1代的花瓣進(jìn)行測(cè)定，5個(gè)色系的參數(shù)值的分布范圍如表1所示。

表1 F1代各色系花色CIELab參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistical analysis on CIELab parameters of different petal color groups in F1population

利用箱線(xiàn)圖（圖2）對(duì)各色系的CIELab顏色系統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，各色系L*、a*、b*值分布特征有一定的規(guī)律，可以將5個(gè)色系分開(kāi)。黃色系、白色系L*值較大且分布集中，a*值低且有負(fù)值分布；白色系b*值偏低，但黃色系b*值分布較廣泛；紅色系的L*值小于其他色系，而a*值明顯高于其他色系；粉色系的L*值與a*值分布范圍相對(duì)寬泛，但是b*值明顯偏?。怀壬?個(gè)參數(shù)分布都較廣泛。

圖2 作圖群體各色系L*、a*、b*值箱線(xiàn)圖Figure 2 The box plot of different color groups of the segregating population according to L*，a*，b*

作圖群體在a*、b*色相坐標(biāo)系中的分布如圖3A所示，5個(gè)色系呈分散分布但色系內(nèi)明顯聚集，主要集中分布在第Ⅰ象限，部分黃色、白色系分布在第Ⅱ象限，而代表藍(lán)色、紫色的第Ⅲ、Ⅳ象限沒(méi)有分布。通過(guò) L*、a*值散點(diǎn)圖（圖 3C）可以看出，L*與 a*呈負(fù)相關(guān)，擬合的線(xiàn)性回歸方程為y=-0.53x+86.494（R2=0.95）。L*、a*、b*值三維坐標(biāo)圖（圖 3B）可以更加直觀(guān)地展示各個(gè)花色的分布規(guī)律，總體上各色系呈三維帶狀分布，粉色、紅色系分布距離更接近a*軸和L*軸下部，顏色越黃距離b*軸越近。

不同色系的明度L*與飽和度C之間的關(guān)系不同，根據(jù)被測(cè)植株的L*值和C值在二維坐標(biāo)的分布，可將其分為兩個(gè)類(lèi)群（圖3D）。第一類(lèi)群包括白色和黃色系，L*值隨C值的增大而減小，斜率較小，散點(diǎn)分布幾乎平行于x軸（圖4A）；第二類(lèi)群包括粉色、紅色和橙色系，L*值隨C值增大顯著減小，斜率較大（圖4B）。第一類(lèi)群L*值與C值線(xiàn)性回歸擬合水平并不顯著（R2=0.20），第二類(lèi)群的L*值與C值之間線(xiàn)性回歸擬合水平較顯著（R2=0.76），擬合函數(shù)為y=-0.541 4x+93.298。

圖3 作圖群體花色表型分布圖Figure 3 Flower color distribution of the segregating population

圖4 作圖群體L*值與C值關(guān)系Figure 4 Relationships between L*and C among segregating population

2.3 新葉SPAD值、花青苷含量、色差值與花瓣色差值相關(guān)性分析

在對(duì)F1代植株各色系新葉花青苷含量、SPAD值、色差值統(tǒng)計(jì)分析（表2）中得出，紅色系新葉花青苷平均含量最高，新葉L*均值較小、a*均值最大、C均值最小，說(shuō)明其新葉色較紅、較暗、飽和度較低。而白色、黃色系花的參數(shù)值表現(xiàn)出相反的特征，新葉花青苷平均含量低、新葉亮度高，葉色偏綠、飽和度較高。粉色系與橙色系的花青苷含量和新葉L*、a*均值居于紅色和白黃色系之間。

表2 F1代植株各色系新葉花青苷含量、SPAD值、色差值統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistical analysis on SPAD value,anthocyanin content and CIELab parameters of different color groups in F1population

花瓣L*、a*、C值、新葉花青苷含量與新葉5個(gè)色差參數(shù)間都呈現(xiàn)極顯著相關(guān)（表3）?；ò闘*和a*與新葉花青苷含量的相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.400和0.439，回歸方程分別為：y=-5.527 4x+80.829（R2=0.16）、y=11.091x+9.827 1（R2=0.19）。此外花瓣飽和度C與新葉花青苷含量也呈極顯著正相關(guān)；在葉色色差與花色色差值的相關(guān)性中，新葉L*值和花瓣L*值、新葉a*值和花瓣a*值之間均呈極顯著正相關(guān)，新葉a*值與花瓣L*值、新葉L*值與花瓣a*值、新葉C值和花瓣C值呈極顯著負(fù)相關(guān)。說(shuō)明葉色越亮則花色越亮，葉色越紅則花色越紅，葉色越紅花色越暗，葉色越暗花色越紅?；ò晟钪蹬cSPAD值的相關(guān)性較弱，僅與花色b*、h間存在正相關(guān)和負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表3 F1代植株新葉SPAD值、新葉花青苷含量、色差值與花瓣色差值之間的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between new leaf SPAD value,anthocyanin content,chromatic aberration and flower chromatic aberration in F1population

3 討論與結(jié)論

花色是月季重要的觀(guān)賞性狀，“云蒸霞蔚”ד太陽(yáng)城”的F1代5個(gè)花色色系的植株在a*和b*二維象限圖中主要分布在第Ⅰ象限，部分白色和黃色系資源分布在第Ⅱ象限，而在代表紫色、藍(lán)色的Ⅲ和Ⅳ象限沒(méi)有分布。這是由于在月季資源中缺少合成飛燕草素苷的關(guān)鍵酶—F3’5’H，導(dǎo)致月季代謝途徑中只存在形成紅色的天竺葵素苷和矢車(chē)菊素苷兩條代謝通路，使整個(gè)月季資源中沒(méi)有真正的藍(lán)色花[13]。因此在月季花色的改良育種工作中，進(jìn)一步豐富月季中花青素苷合成途徑的基因資源，建立飛燕草素苷生物合成途徑，對(duì)培育藍(lán)色月季具有重要意義。

在現(xiàn)代月季的研究、選育與生產(chǎn)工作中，研究者通常需等到月季開(kāi)花后才能對(duì)其花色進(jìn)行分辨，使得現(xiàn)代月季的育種周期延長(zhǎng)，因此開(kāi)展早期預(yù)選研究對(duì)縮短育種周期有重要意義。在植物發(fā)育中，不同器官之間存在相關(guān)性，林木早期選擇就是是利用幼年與后期性狀的相關(guān)性，對(duì)生長(zhǎng)作出預(yù)測(cè)，從而縮短育種評(píng)定時(shí)間,提高選擇效率[14-15]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)多個(gè)樹(shù)種開(kāi)展了早期選擇研究,取得了重大進(jìn)展[16-18]。在觀(guān)賞植物中也有對(duì)早期選擇的研究。孫凡雅等研究發(fā)現(xiàn)，觀(guān)賞海棠父本木質(zhì)部與其花瓣花色苷含量的存在顯著相關(guān)性，可以利用木質(zhì)部花色苷含量可以對(duì)雜交后代的花色、果色進(jìn)行預(yù)選[19]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討月季新葉花青苷含量、SPAD值、色差值與花色的相關(guān)性，能夠通過(guò)月季早春新葉推測(cè)花色，能夠在一定程度上對(duì)月季進(jìn)行早期選擇。

圖5 作圖群體新葉花青苷含量與花瓣L*值、a*值關(guān)系Figure 5 Relationships between new leaf anthocyanin content with petal L*and a*among segregating population

程怡等[8]研究粉色月季品種‘仙境’發(fā)現(xiàn)花青苷對(duì)花色形成起直接作用，本實(shí)驗(yàn)中新葉花青苷含量與花瓣L*和a*的關(guān)系是所有葉色參數(shù)與花色參數(shù)中關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的。在對(duì)新葉花青苷含量與花色的相關(guān)性分析中得出，花青苷含量與花瓣L*值呈顯著負(fù)相關(guān)，與a*和C呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明新葉花青苷含量越高，花色越紅、越暗、色彩飽和度越低；花青苷含量低，花色偏黃色和白色。在月季葉色和花色的相關(guān)性研究中，唐仕榮[5]發(fā)現(xiàn)月季嫩枝莖葉的顏色與開(kāi)花花色存在一定的對(duì)應(yīng)規(guī)律，如嫩枝莖葉為紅色，其花色多為紅色，且紅的程度決定花朵紅色的程度。王升等[6]對(duì)月季花色與幼嫩芽、葉的相關(guān)性進(jìn)行分析也發(fā)現(xiàn)，月季嫩芽、嫩葉顏色較深的品種花色往往較深。本試驗(yàn)通CIELab系統(tǒng)對(duì)花色與葉色進(jìn)行量化描述，進(jìn)一步驗(yàn)證了前人的結(jié)論。試驗(yàn)得出，新葉L*值和花瓣L*值、新葉a*值和花瓣a*值之間均呈顯著正相關(guān)，新葉a*值與花瓣L*值、新葉L*值與花瓣a*值以及新葉C與花色C值間呈顯著負(fù)相關(guān)。

綜上所述，新葉花青苷含量越低、L*值（亮度）越大（亮）、a*值越?。ㄐ氯~色越綠）、C均值越大（色彩飽和度高）則花色L*值（亮度）越大（亮）、a*值越小，花色偏白色和黃色系。反之，花色偏紅色系和橙色系。