李 燕，王 賀，朱 勇，張凌荔，魯均華，王文明

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點實驗室，成都 611130）

水稻是全球最重要的糧食作物之一。產(chǎn)量、生育期和抗性是水稻生產(chǎn)中的3個關(guān)鍵因素。然而，抗性與產(chǎn)量之間往往存在拮抗作用，免疫激活和抗病性的提高，常常以犧牲產(chǎn)量為代價，成為抗病種質(zhì)創(chuàng)新的一個瓶頸問題[1-2]。同時，產(chǎn)量和生育期之間也存在平衡關(guān)系，高產(chǎn)的種質(zhì)資源往往具有較長的全生育期[3-4]，不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高效節(jié)能。目前，還沒有單一基因可同時增產(chǎn)、增抗并縮短生育期的相關(guān)報道。尋找能同時協(xié)調(diào)上述三要素的基因，可為水稻高產(chǎn)抗病研究提供新的理論基礎(chǔ)和備選基因資源。

MicroRNA（miRNA）是生物體內(nèi)源的長度約為19～24個堿基的單鏈 RNA，與 Argonaute（AGO）蛋白結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC），結(jié)合到與miRNA反向互補的DNA或RNA上，通過介導(dǎo)DNA甲基化修飾，RNA切割，以及阻斷mRNA翻譯等，調(diào)控基因表達(dá)。miRNA全方位控制植物的生長，發(fā)育和免疫[5-6]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Osa-miR168（miR168）受稻瘟菌侵染誘導(dǎo)，而miR168的靶標(biāo)基因編碼了RISC的關(guān)鍵組成蛋白AGO1（AGO1a，AGO1b，AGO1c，AGO1d）。但是，miR168 如何通過AGO1調(diào)節(jié)稻瘟病抗性，以及如何影響水稻生長發(fā)育尚不清楚。

為了進(jìn)一步研究miR168在稻瘟病抗性中的作用，我們構(gòu)建了過表達(dá)miR168的轉(zhuǎn)基因材料OX168，以及抑制miR168功能的轉(zhuǎn)基因材料 MIM168。OX168材料中miR168累積顯著增加，AGO1表達(dá)水平顯著降低；反之，MIM168材料中miR168累積減少，AGO1表達(dá)增加。農(nóng)藝性狀分析顯示，與對照相比，OX168株高增加，有效分蘗顯著減少，千粒重有所增加；相反，MIM168株高降低，有效分蘗顯著增加，千粒重有所降低。另外，OX168的營養(yǎng)生長期延長，花期延遲，籽粒晚熟；而MIM168營養(yǎng)生長期縮短，花期提前，籽粒早熟。這些結(jié)果說明，改變miR168在水稻中的累積，可以影響水稻的農(nóng)藝性狀和生育期，并可能影響產(chǎn)量。進(jìn)一步連續(xù)3年的大田產(chǎn)量分析結(jié)果顯示，在水稻正常生長季節(jié)，與對照相比，MIM168增產(chǎn)30%～40%，但OX168減產(chǎn)20%～40%。這一結(jié)果證明，抑制miR168的功能，可以有效提高水稻產(chǎn)量。

我們的前期研究結(jié)果顯示，miR168響應(yīng)稻瘟菌侵染[7]。病圃抗性壓力實驗結(jié)果顯示，與正常大田種植材料相比，對照材料減產(chǎn)約13%，MIM168材料減產(chǎn)僅4%左右，與對照相比增產(chǎn)最高達(dá)75%，而OX168則減產(chǎn) 20%～40%，說明抑制miR168的功能，可以提高稻瘟病抗性和保障增產(chǎn)。我們進(jìn)一步在實驗室內(nèi)分析了轉(zhuǎn)基因材料對3個不同來源的稻瘟菌株（國際通用菌株，中國北方和南方大田分離菌株）的抗性反應(yīng)。與大田實驗結(jié)果一致，與對照相比，MIM168對這3個菌株的抗病性均增強，侵染部位的病斑面積減小，菌量減少，而OX168則呈現(xiàn)相反的表型。另外，OX168材料上稻瘟菌的侵染進(jìn)程顯著加快，侵染部位H2O2累積減少，H2O2合成相關(guān)基因和抗性相關(guān)基因的表達(dá)水平也顯著降低；相反，MIM168材料中稻瘟菌的侵染進(jìn)程顯著延遲，H2O2累積增加，相關(guān)基因的誘導(dǎo)水平也顯著提高。這些結(jié)果證明，miR168削弱稻瘟病抗性，而抑制miR168的功能可以增強稻瘟病抗性。

為了明確miR168是否通過AGO1來調(diào)控水稻生長發(fā)育和抗性，我們構(gòu)建了沉默AGO1的轉(zhuǎn)基因材料（AGO1i），AGO1的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因材料中被顯著抑制。與OX168材料的表型一致，AGO1i株高增加，籽粒變大，有效分蘗減少，產(chǎn)量顯著降低；同時，AGO1i對稻瘟菌的感病性也顯著增加，稻瘟菌的侵染進(jìn)程加快，侵染部位H2O2的累積也顯著減少，暗示miR168通過AGO1調(diào)控水稻生長和抗性。

我們接下來分析miR168-AGO1模塊通過哪些下游信號通路調(diào)控水稻生長和抗性。因為miR168-AGO1模塊調(diào)控整個miRNA網(wǎng)絡(luò)，我們分別在水稻苗期和分蘗期收集水稻葉片，在孕穗期收集幼穗，提取RNA，進(jìn)行小RNA高通量測序分析。結(jié)果顯示，與對照水稻材料相比，很多miRNA的累積在OX168和MIM168中都發(fā)生了顯著的改變。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，苗期有162個，分蘗期有156個，抽穗期有197個miRNA的表達(dá)受miR168影響。在這些被調(diào)控的miRNA中，15個miRNA已被報道參與調(diào)控水稻的生長發(fā)育[6，8-10]。同時，通過與我們原來發(fā)表的數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉比對[7]，篩選出了54個既受miR168影響，又響應(yīng)稻瘟菌侵染的miRNA。在這些miRNA中，有 9 個已經(jīng)被驗證參與調(diào)控稻瘟病抗性[5，7，11-16]。與此相呼應(yīng)，與對照材料相比，這些miRNA靶基因的表達(dá)水平在OX168和MIM168材料中也有變化。這些結(jié)果暗示，miR168-AGO1模塊可能通過調(diào)控下游的miRNA累積來影響水稻生長和抗性，并且，應(yīng)該有部分miRNA起關(guān)鍵作用。

進(jìn)一步篩選可能起關(guān)鍵調(diào)控功能的miRNA發(fā)現(xiàn)，在苗期和分蘗期葉片中，miR1320的累積量在MIM168中增加，在OX168中降低。另外，在稻瘟菌侵染條件下，miR1320的累積在抗性材料IRBLkm-Ts中增加，而在感病材料LTH中降低，暗示miR1320參與了miR168對稻瘟病抗性的調(diào)控。為了驗證這一猜想，我們分別構(gòu)建了野生型背景下的miR1320的過表達(dá)材料（OX1320），抑制miR1320功能的轉(zhuǎn)基因材料（MIM1320），以及在OX168和MIM168背景下的過表達(dá)材料（OX1320/OX168和OX1320/MIM168）。我們對上述材料進(jìn)行抗性分析發(fā)現(xiàn)，OX1320材料稻瘟病抗性顯著增強，稻瘟菌侵染進(jìn)程延遲，H2O2累積和抗性相關(guān)基因的表達(dá)水平也顯著提高，而MIM1320則呈現(xiàn)相反的表型。另外，OX1320/OX168材料的抗性顯著高于OX168材料，而OX1320/MIM168抗性也顯著高于MIM168。有意思的是，OX1320雖然抗性增強，但產(chǎn)量與對照相比無顯著差異。這些結(jié)果說明，miR1320參與了對稻瘟病抗性的調(diào)控，但不影響產(chǎn)量。

miR156，miR529和miR535都靶定SQUAMOSA promoter binding protein-like（SPL）14。SPL14 編碼一個調(diào)控水稻理想株型的蛋白IPA1，抑制水稻分蘗，但促進(jìn)穗發(fā)育[8，17-18]。我們檢測了這些miRNA在OX168和MIM168材料分蘗期的莖端分生組織中的累積量。miR156的累積無顯著變化，miR529的累積量低于檢測閾值。然而，在分蘗早期，miR535的累積在OX168中降低，在MIM168中增加；到了分蘗后期，miR535的累積在OX168和MIM168中均降低。與miR535的累積模式相反，在MIM168的莖端分生組織中，靶基因SPL14的表達(dá)在分蘗早期被抑制，在分蘗后期則被上調(diào)。這些結(jié)果暗示，miR168-AGO1模塊可能通過miR535調(diào)控分蘗和穗發(fā)育。

為了進(jìn)一步檢測miR535在miR168-AGO1模塊調(diào)控分蘗的信號通路中的作用，我們分別構(gòu)建了野生型背景下的miR535的過表達(dá)材料（OX535），抑制miR535功能的轉(zhuǎn)基因材料（MIM535），以及在OX168和MIM168背景下的過表達(dá)材料（OX535/OX168和OX535/MIM168）。SPL14的表達(dá)水平在OX535材料中被顯著抑制，反之，在MIM535材料中顯著提高，說明miR535能有效抑制SPL14的表達(dá)。OX535材料的分蘗數(shù)達(dá)到對照的2～3倍，但穗型變小，結(jié)實率下降；相反，MIM535材料的分蘗數(shù)與對照相比無顯著差異，但穗型變大，每穗粒數(shù)增加，導(dǎo)致單株產(chǎn)量增加。與此一致，OX535/OX168和OX535/MIM168材料的分蘗數(shù)都顯著高于其各自的背景材料OX168和MIM168。另外，MIM535抗性增強，而OX535抗性減弱。這些結(jié)果暗示，在苗期到分蘗早期的轉(zhuǎn)變過程中，MIM168材料中miR535的累積增加，抑制SPL14的表達(dá)，從而促進(jìn)分蘗，但影響抗性；而進(jìn)入分蘗后期時，miR535累積減少，SPL14表達(dá)增加，從而抑制無效分蘗的形成，促進(jìn)穗發(fā)育，并提高抗性。

我們也篩選了可能影響生育期的miRNA。測序數(shù)據(jù)顯示，在抽穗期，與對照材料相比，miR164在MIM168材料中的累積降低，而在OX168中無顯著差異。相反，miR164的靶基因NAC11，被報道可促進(jìn)早花[19]，在MIM168材料中的表達(dá)顯著增加，暗示在MIM168中，miR164在抽穗期的低累積促進(jìn)了NAC11的表達(dá)，從而促進(jìn)早花。為了進(jìn)一步檢測miR164是否真的參與miR168-AGO1模塊調(diào)控生育期的信號通路，我們分別構(gòu)建了野生型背景下的miR164過表達(dá)材料（OX164），抑制miR164功能的轉(zhuǎn)基因材料（MIM164），以及在OX168和MIM168背景下的過表達(dá)材料（OX164/OX168和OX164/MIM168）。與對照相比，OX164材料株型變矮，花期延遲4 d左右，NAC11的表達(dá)水平顯著降低；與MIM168相比，OX164/MIM168花期也延遲3 d左右；相反，MIM164材料株型基本不變，花期提前5 d左右，NAC11和開花相關(guān)基因Hd3a和RFT1的表達(dá)水平也顯著提高。另外，我們還構(gòu)建了NAC11的兩個突變體nac11-1和nac11-2，發(fā)現(xiàn)這兩個突變體的花期均比對照有所延遲。這些結(jié)果說明，miR164-NAC11模塊參與了miR168-AGO1模塊調(diào)控的水稻生育期。

同時，在苗期和抽穗期，miR164的累積在OX168中增加，而在MIM168中有所降低。與此相吻合，OX164材料的稻瘟病抗性降低，而MIM164材料的抗性增強；OX164/OX168材料的抗性顯著低于OX168，而OX164/MIM168的抗性也顯著低于MIM168。這些結(jié)果說明，miR164也參與了miR168-AGO1模塊調(diào)控的水稻稻瘟病抗性。

作物產(chǎn)量與全生育期密切相關(guān)，與抗性之間也存在拮抗關(guān)系。在這一研究中，我們發(fā)現(xiàn)抑制miR168的功能，可以提高水稻產(chǎn)量，促進(jìn)早花，并提高稻瘟病抗性。miR168-AGO1模塊影響了整個miRNA網(wǎng)絡(luò)。其中，通過miR1320提高稻瘟病抗性，通過miR535調(diào)控分蘗、穗發(fā)育和抗性，通過miR164控制花期和抗性（圖1）。需要指出，應(yīng)該還有受miR168-AGO1模塊調(diào)控的其他很多miRNA也參與調(diào)控水稻產(chǎn)量、生育期以及抗性，這些miRNA的具體功能有待進(jìn)一步研究。

圖1 miR168-AGO1s模塊通過3個miRNA調(diào)控水稻免疫和生長發(fā)育的模式圖Figure 1 Model for miR168-AGO1s regulating rice immunity and growth through three miRNAs