孫悅，趙艷春，張婷，葛文文，王鐵鵬

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000)

帕金森氏癥(Parkinson’s Disease,PD)是由于環(huán)境或遺傳原因?qū)е碌闹心X黑質(zhì)區(qū)退行性疾病，表現(xiàn)為多巴胺能神經(jīng)元丟失，引起手足顫抖、僵硬、動作緩慢、站立不穩(wěn)等表現(xiàn)。帕金森氏癥一般在50歲后發(fā)病，發(fā)病風(fēng)險隨著年齡增長而升高，已成為困擾人類的第二大神經(jīng)退行性疾病[1]。

一氧化氮(Nitric oxide,NO)是引發(fā)帕金森氏癥的重要致病性介質(zhì)[2]，主要通過硝化應(yīng)激效應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷及神經(jīng)系統(tǒng)病變。PD發(fā)生伴隨炎癥反應(yīng)，病變組織中激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中可誘導(dǎo)iNOS(Inducible nitric oxide synthase)生成，產(chǎn)生大量一氧化氮，作用于周邊神經(jīng)元，發(fā)生硝化應(yīng)激[3]。通過解剖PD病人組織樣本發(fā)現(xiàn)，NO與PD發(fā)病的過程關(guān)系非常密切[4]。在使用天然毒素魚藤酮等制備的大鼠、小鼠等PD動物模型中，也體現(xiàn)出NO的重要作用[4-5]。

魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞是構(gòu)建PD神經(jīng)細(xì)胞模型的最常用方法之一，該模型可以模擬出含α-突觸核蛋白(α-synuclein)等成分的路易小體類似物，與PD細(xì)胞病理表現(xiàn)相似而被較廣泛地使用[6]。那么，在魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中，是否能夠產(chǎn)生NO，NO的存在對于PD細(xì)胞模型是否必要呢？一些文獻(xiàn)對此進(jìn)行了報道，但報道不統(tǒng)一，甚至有些矛盾。Yin等報道，魚藤酮處理致使神經(jīng)元去極化，可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞NMDAR受體開放，內(nèi)流的鈣離子引起nNOS激活，產(chǎn)生NO[7]。但是在SH-SY5Y細(xì)胞中，NMDAR受體的亞基表達(dá)不足，可能無法形成有功能的鈣離子通道，因而，魚藤酮可能無法通過神經(jīng)元中的經(jīng)典途徑誘導(dǎo)NO生成[8]。

魚藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞體系中能否產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮對于魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型是否具有顯著的調(diào)節(jié)作用等問題尚不明確。本工作對這一問題展開研究，以期對魚藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞系模型中一氧化氮的作用加以確認(rèn)。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物武漢大學(xué)保藏中心細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶(含EDTA)、青霉素-鏈霉素混合液購自Gibco；胎牛血清購自Biological Industries；魚藤酮、Hoechst 33342、MTT、DMSO購自Sigma；硝酸纖維素膜購自PALL；麗春紅S購自Merck；Tyrosine Hydroxylase抗體購自Millipore；α-synuclein抗體購自Santa Cruz；GAPDH抗體購自Bioworld；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Thermo Fisher；蛋白酶抑制劑Cocktail、BCA蛋白定量試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；NO檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Dopamine ELISA Kit購自Elabscience；Mito Tracker Red CMXRos購自Molecular Probes；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，添加100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素，細(xì)胞傳代采用0.25%胰酶消化細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基終止消化。細(xì)胞接種24 h左右，根據(jù)不同條件進(jìn)行刺激。魚藤酮及GSNO采用完全培養(yǎng)基溶解，刺激細(xì)胞時采取全換液的方式進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測MTT

96孔板各孔接種4×104SH-SY5Y細(xì)胞，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后施加不同條件進(jìn)行處理。刺激結(jié)束后，各孔加入20 μL MTT(終濃度為0.5 g·L-1)，培養(yǎng)箱中避光孵育3 h。各孔棄除培養(yǎng)基，加入200 μL DMSO，搖床震蕩15 min，使結(jié)晶充分溶解。將96孔板置于酶標(biāo)儀中，讀取565 nm波長處吸光度值A(chǔ)值，空白孔加入相同體積DMSO為培養(yǎng)板本底對照。

1.2.3 一氧化氮含量檢測

傳代細(xì)胞接種于6孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞經(jīng)不同條件處理后，棄除培養(yǎng)基，用Locke’s緩沖液洗細(xì)胞2次后，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解細(xì)胞20 min。14000 g離心20 min，取上清，BCA試劑盒對細(xì)胞抽提物進(jìn)行蛋白定量。按照檢測試劑盒步驟，避光條件下在96孔板各孔加入50 μL試劑Ⅰ和試劑Ⅱ，再加入150 μL檢測樣品，混勻，于酶標(biāo)儀540 nm處讀取吸光度值，按照既定公式計算NO含量。

1.2.4 細(xì)胞核染色

DNA染料Hoechst 33342(5 μg·mL-1)采用完全培養(yǎng)基(含10% FBS)配制。細(xì)胞接種于6孔板中，經(jīng)不同條件處理后吸盡培養(yǎng)基，加入DNA染料標(biāo)記10 min。使用Locke’s緩沖液清洗細(xì)胞2次，冰甲醇固定細(xì)胞30 min，棄去固定液。培養(yǎng)皿中加入1 mL Locke’s液，于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.5 Western Blot

采用RIPA裂解液(包含蛋白酶抑制劑Cocktail)破碎細(xì)胞提取蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，每個泳道上樣量為20 μg。采用濕轉(zhuǎn)法，恒壓(80 V)條件將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。麗春紅S染色觀察條帶位置后進(jìn)行裁膜，1×TBST洗脫后使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，1×TBST清洗NC膜2次，一抗4 ℃條件下孵育過夜。次日，1×TBST洗NC膜4次，每次10 min。二抗室溫孵育NC膜2 h，1×TBST洗膜4次，每次10 min。NC膜上滴加化學(xué)發(fā)光液，使用Fluo Chem HD-2 成像儀采集圖片并進(jìn)行定量分析。

1.2.6 多巴胺含量檢測

細(xì)胞接種于100 mm直徑培養(yǎng)皿中，經(jīng)不同條件處理后，用Locke’s液清洗細(xì)胞2次，胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞。使用預(yù)冷Locke’s再次清洗細(xì)胞3次，加入蛋白酶抑制劑Cocktail，超聲破碎細(xì)胞后離心(1500 g,10 min)，收集上清。細(xì)胞內(nèi)多巴胺水平的檢測按照DA酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒說明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度DA結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中實際多巴胺濃度。

1.2.7 細(xì)胞膜電位檢測

接種于培養(yǎng)皿的SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)不同條件處理后，加入Mito Tracker Red染色液(10 mmol·L-1)，于37 ℃培養(yǎng)條件下染色30 min。Locke’s緩沖液清洗細(xì)胞2次，使用預(yù)冷甲醇室溫固定細(xì)胞30 min。棄去固定液，DNA染料標(biāo)記10 min，Locke’s緩沖液清洗細(xì)胞2次，加入1 mL Locke’s液，熒光顯微鏡(汞燈綠色激發(fā)光通道)下觀察、采集圖片，紅色熒光越強(qiáng)，代表細(xì)胞膜電位越高。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞的劑量和時間效應(yīng)

為了摸索魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞的合適濃度，我們采用不同濃度的魚藤酮處理細(xì)胞24 h，用MTT法檢測不同條件下魚藤酮對細(xì)胞活力的影響(圖1A)。結(jié)果顯示，隨著魚藤酮濃度增高，神經(jīng)細(xì)胞活力逐漸降低，100 nmol·L-1濃度時，細(xì)胞活力下降到對照組的56.52%。接著，采用100 nmol·L-1魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞不同時間，檢測魚藤酮對神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的時間曲線，結(jié)果顯示，處理12 h后，細(xì)胞活力顯著降低，處理24 h時，細(xì)胞活力為對照組65.08%(圖1B)。由此，確認(rèn)100 nmol·L-1魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h為較合適的實驗條件。

圖1 魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞的濃度和時間效應(yīng)

2.2 魚藤酮細(xì)胞模型中一氧化氮毒性及含量檢測

鑒于文獻(xiàn)中關(guān)于采用一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)抑制劑可以保護(hù)魚藤酮誘導(dǎo)的大鼠PD模型的報道[9]，我們采用廣譜型NOS抑制劑L-NAME(L-nitro-arginine-methylester)及神經(jīng)型NOS(neuronal NOS)特異性抑制劑7-NI(7-nitroindazole)處理細(xì)胞，驗證其是否能夠保護(hù)魚藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性。L-NAME的使用濃度為200 μmol·L-1，7-NI的使用濃度為100 μmol·L-1。結(jié)果如圖2A所示，單獨(dú)的L-NAME及7-NI對神經(jīng)細(xì)胞均沒有毒性；魚藤酮處理組細(xì)胞活性顯著降低；但是，在魚藤酮處理下，無論是廣譜型NOS抑制劑L-NAME還是神經(jīng)細(xì)胞特異性抑制劑7-NI均未表現(xiàn)出對魚藤酮細(xì)胞毒性的顯著保護(hù)作用。針對魚藤酮是否可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞生成NO的問題，我們采用一氧化氮檢測試劑盒，并以外源性一氧化氮供體 GSNO(500 μmol·L-1)作為陽性對照，分別檢測了100 μmol·L-1魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞1、6、9、12、16、24 h條件下神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NO水平，檢測結(jié)果顯示，上述各時間點與對照組相比，均未能顯著提升細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮水平(圖2B)。結(jié)果表明，在魚藤酮處理的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞中一氧化氮并沒有發(fā)揮主要作用。

圖2 魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞中一氧化氮功能及含量檢測

2.3 外源性一氧化氮劑量的確認(rèn)

外源性一氧化氮劑量的確認(rèn)結(jié)果見圖3。

***，P<0.001，與對照組相比；ns，無顯著性差異，與單獨(dú)魚藤酮處理組相比；#，P<0.05，與單獨(dú)魚藤酮處理組相比；##，P<0.01，與單獨(dú)魚藤酮處理組相比。

鑒于在帕金森氏癥病變過程中，神經(jīng)元接受的NO信號刺激主要來自于周邊的膠質(zhì)細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞)中iNOS生成的NO，即神經(jīng)細(xì)胞受到細(xì)胞外高濃度NO的刺激，我們嘗試通過在魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中添加外源性NO供體(GSNO)的方式，研究NO對該P(yáng)D細(xì)胞模型的調(diào)節(jié)作用。通過在魚藤酮處理模型中添加不同濃度GSNO進(jìn)行細(xì)胞活力摸索，發(fā)現(xiàn)GSNO濃度達(dá)到500 μmol·L-1以上時，細(xì)胞活力降低較為明顯(圖3)，因此確定在后續(xù)實驗體系中采用100 nmol·L-1魚藤酮結(jié)合500 μmol·L-1GSNO的處理濃度刺激24 h作為研究條件，此時細(xì)胞MTT活力降低至對照組48.14%。

2.4 一氧化氮對魚藤酮模型細(xì)胞形態(tài)的影響

為了驗證加入外源NO對魚藤酮毒性模型的影響，我們首先檢測了GSNO與魚藤酮聯(lián)合處理16 h對細(xì)胞可見光形態(tài)及細(xì)胞核DNA形態(tài)的影響。結(jié)果顯示，單獨(dú)的魚藤酮可引起細(xì)胞損傷，損傷細(xì)胞的DNA濃縮、高亮比例增加，損傷細(xì)胞的胞體先變圓后脫落，并未有“腫脹”的表現(xiàn)(圖4)。GSNO單獨(dú)處理組和聯(lián)合處理組中，細(xì)胞核DNA濃縮比例比單獨(dú)魚藤酮組略有增加，但胞體形態(tài)呈現(xiàn)膨脹、細(xì)胞核凸出等較典型的“脹亡”形態(tài)(圖4)。上述結(jié)果表明，一氧化氮的加入，使魚藤酮處理的神經(jīng)細(xì)胞系死亡模式發(fā)生了顯著改變，轉(zhuǎn)為壞死模式。

2.5 一氧化氮對魚藤酮模型多巴胺合成的影響

多巴胺分泌不足及多巴胺能神經(jīng)元死亡導(dǎo)致黑質(zhì)向紋狀體神經(jīng)投射信號減弱，是帕金森氏癥發(fā)生的直接原因[10]。酪氨酸羥化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)是合成神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的限速酶，該酶的表達(dá)在PD病人或動物模型中顯著降低[11]。魚藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞中，酪氨酸羥化酶的表達(dá)情況及加入外源性NO供體共處理后，酪氨酸羥化酶的表達(dá)是否會有進(jìn)一步改變目前尚未明確。我們的實驗結(jié)果表明，單純100 nmol·L-1魚藤酮處理細(xì)胞后，酪氨酸羥化酶的蛋白表達(dá)并未發(fā)生顯著改變，NO處理組的酪氨酸羥化酶明顯降低至對照組的85.16%，魚藤酮與NO聯(lián)合處理組的酪氨酸羥化酶下降水平更加明顯，降低到對照組的78.52%(圖5A)。結(jié)果表明，外源性NO對于酪氨酸羥化酶蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用比魚藤酮要更加顯著。于此同時，我們檢測了不同刺激條件下，神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的含量，結(jié)果顯示魚藤酮組的DA含量降低至對照組56.04%左右，單獨(dú)的NO處理也能顯著降低DA含量(至對照組78.92%)，而聯(lián)合刺激組的DA降低最顯著，降低至對照組的32.32%(圖5B)。

圖5 魚藤酮和一氧化氮對酪氨酸羥化酶及多巴胺含量的影響

2.6 一氧化氮對魚藤酮模型線粒體膜電位的影響

基于細(xì)胞和動物模型的研究表明，線粒體異常所致供能障礙是PD神經(jīng)元病變的主要誘因之一[6-7]，供能不足最直接的影響之一是導(dǎo)致線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential,MMP)降低。經(jīng)典的PD造模劑，如MPTP(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)、6-羥多巴胺、魚藤酮、百草枯等均通過抑制線粒體呼吸鏈I介導(dǎo)PD模型神經(jīng)細(xì)胞的損傷[6-7]。多巴胺能神經(jīng)元線粒體膜電位降低是PD疾病模型的經(jīng)典指標(biāo)，也是介導(dǎo)神經(jīng)元死亡的重要因素[12]，我們采用線粒體膜電位探針Mito Tracker Red CMXROS對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記[13]，并檢驗了不同刺激組別中線粒體膜電位的改變。

結(jié)果顯示，對照組熒光色度最強(qiáng)，表明線粒體膜電位水平較高，魚藤酮處理組與對照組相比發(fā)生了明顯的膜電位下降，GSNO組處理也能顯著降低細(xì)胞膜電位，聯(lián)合處理組細(xì)胞的線粒體膜電位降低幅度最大，對細(xì)胞損傷最為嚴(yán)重(圖6)。

圖6 魚藤酮及一氧化氮處理對神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.7 一氧化氮對魚藤酮模型α-突觸核蛋白含量的影響

路易小體的形成是PD病理檢測中的重要特征性指標(biāo)[14]，路易小體的形成主要源自α-突觸核蛋白表達(dá)的異常增高及無規(guī)則纏結(jié)。我們檢測了魚藤酮處理下及NO聯(lián)合處理下神經(jīng)細(xì)胞中的α-突觸核蛋白含量。結(jié)果顯示，魚藤酮處理后，細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白含量明顯增加至對照組的117.97%，而加入GSNO處理也能顯著增加α-突觸核蛋白表達(dá)水平(至對照組130.54%)，聯(lián)合處理組的蛋白上調(diào)作用最顯著(至對照組137.67%)，(圖7)。聯(lián)合處理組中α-突觸核蛋白表達(dá)水平的升高表明，一氧化氮共處理可以使單純魚藤酮刺激模型更接近帕金森氏癥神經(jīng)元病變的真實情況。

圖7 魚藤酮和一氧化氮對α-突觸核蛋白含量的影響

3 討論

一氧化氮在帕金森氏癥多巴胺能神經(jīng)元的退變過程中扮演重要角色，對于神經(jīng)元而言，其接受的一氧化氮刺激，主要有兩個來源。首先，一氧化氮來源中腦病變組織中的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)nNOS被激活而生成[15]；其次，PD的發(fā)生始終伴隨著炎癥反應(yīng)，病變組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中的iNOS被激活，釋放比神經(jīng)元中nNOS來源更高濃度的NO。由于NO有較好的跨膜特性，很容易到達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)神經(jīng)毒性作用[16]。相對于神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)生成的NO，來自膠質(zhì)細(xì)胞的“外源性”NO濃度更高，毒性作用更強(qiáng)，這種作用機(jī)制也為PD細(xì)胞模型中加入外源性NO供體GSNO提供了病理學(xué)支持。

已有的報道表明，NO在帕金森氏癥神經(jīng)元損傷中主要通過抑制線粒體呼吸鏈活性、cGMP途徑、可逆的亞硝基化修飾途徑、不可逆的ONOO-及硝基化修飾方式對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[17]。DEHMER等人[18]的研究顯示，缺乏iNOS的模型動物，PD無法造?；蚴艿斤@著影響；CHALIMONIUK等[19]報道，NO通過cGMP途徑介導(dǎo)PD損傷；NAKAMURA等[20]在綜述中介紹了NO通過對多個蛋白靶點的亞硝基化修飾機(jī)制參與了PD的病變過程。PD疾病發(fā)生中，NO的其他毒性機(jī)制，還在進(jìn)一步探討和發(fā)掘中。

魚藤酮誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡作為PD常用的細(xì)胞模型已經(jīng)應(yīng)用多年，但其中是否體現(xiàn)了NO的作用，缺少詳實的實驗證據(jù)。我們通過實驗發(fā)現(xiàn)，使用100 nmol·L-1的魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞不同時間，細(xì)胞活力明顯降低，但內(nèi)源性NO均不出現(xiàn)顯著提升(圖1、圖2A)，并且使用廣譜型NOS抑制劑L-NAME或者神經(jīng)型NOS特異性抑制劑7-NI均不能有效保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞(圖2B)，這與臨床及動物實驗研究中關(guān)于抑制NOS保護(hù)PD的事實有較明顯的差距，表明魚藤酮處理SH-SY5Y的細(xì)胞模型并不能有效模擬PD機(jī)制中NO的作用。因此，通過引入外源性NO，改善魚藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型，具有必要性。

魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞不能產(chǎn)生顯著的NO，可能由以下原因造成。神經(jīng)元內(nèi)源性NO的生成主要通過細(xì)胞膜上NMDAR受體開放，鈣離子內(nèi)流激活nNOS來生成。但是，在SH-SY5Y細(xì)胞中NMDAR受體亞基的表達(dá)不完善，不能形成功能化的鈣離子通道，因而抑制了神經(jīng)型一氧化氮合酶的活性[8,21]。此外，在PD病理狀態(tài)下，作用于神經(jīng)元的NO更多來自于周圍膠質(zhì)細(xì)胞iNOS產(chǎn)生的高濃度NO，因此在神經(jīng)細(xì)胞PD模型中通過加入膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的條件性培養(yǎng)基[22]或外源性NO[23]，才能更好的模擬體內(nèi)中腦神經(jīng)細(xì)胞死亡的客觀過程。神經(jīng)細(xì)胞損傷后形態(tài)變化、酪氨酸羥化酶蛋白水平、多巴胺遞質(zhì)含量、線粒體膜電位、α-突觸核蛋白含量等是表征PD造模的經(jīng)典指標(biāo)[6,11,14]，在魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中引入外源性NO之后，我們通過檢測上述指標(biāo)，描述一氧化氮對魚藤酮造模的調(diào)節(jié)作用。

從細(xì)胞形態(tài)上看，單獨(dú)的魚藤酮刺激組損傷細(xì)胞呈現(xiàn)先變圓再脫落的類凋亡樣形態(tài)改變；魚藤酮與NO聯(lián)合處理組，損傷細(xì)胞從刺激后6 h開始出現(xiàn)胞體“脹大”的類壞死樣死亡模式，即NO的加入改變了神經(jīng)細(xì)胞的死亡模式(圖4)。關(guān)于魚藤酮誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制，目前的研究報道集中于其通過抑制線粒體呼吸鏈I，導(dǎo)致大量活性氧自由基產(chǎn)生，引發(fā)氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)細(xì)胞，具體的損傷途徑涉及PI3K、AKT、GSK-3β、CREB等不同分子的信號傳遞過程[24-25]。一氧化氮阻止凋亡但誘導(dǎo)細(xì)胞走向壞死等損傷模式可能源于一氧化氮使酶活中心的保守半胱氨酸殘基發(fā)生亞硝基化修飾，抑制凋亡通路中caspase家族水解酶(caspase3、caspase9等)的活性[26]。YOUNG等[27]報道魚藤酮處理的PC12神經(jīng)細(xì)胞以凋亡形式潰變；HE等[28]報道，NO處理的SH-SY5Y細(xì)胞以壞死的形式退行，PERIER等[29]報道，在臨床PD病人的神經(jīng)元死亡表現(xiàn)出壞死的趨勢。這些報道佐證了我們的實驗結(jié)果，也表明魚藤酮處理體系中加入NO是能夠更好地模擬PD病變的建模方式。

神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺合成減少及多巴胺能神經(jīng)元退行是臨床PD病人最明顯的病理特征[10-11]。我們發(fā)現(xiàn)，在采用一氧化氮聯(lián)合魚藤酮處理神經(jīng)細(xì)胞后，能夠更顯著地下調(diào)胞內(nèi)多巴胺合成限速酶(酪氨酸羥化酶)的含量，明顯減低神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)多巴胺水平，比單純魚藤酮處理能更加貼切地模擬PD病理特征(圖5)。一氧化氮誘導(dǎo)酪氨酸羥化酶(TH)含量降低的具體機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報道，但神經(jīng)退行性病變的發(fā)生與神經(jīng)炎癥并行，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS的表達(dá)是神經(jīng)炎癥的標(biāo)志物[30]，且iNOS的表達(dá)與TH含量負(fù)相關(guān)。DANIELA等[31]報道，小鼠外創(chuàng)性腦損傷可導(dǎo)致PD樣病理表型，在小鼠黑質(zhì)區(qū)，iNOS的顯著增加伴隨著酪氨酸羥化酶含量急劇降低。VIJA等[30]報道，小分子有機(jī)物mildronate可對6-羥多巴胺誘導(dǎo)的大鼠PD模型產(chǎn)生明顯保護(hù)作用，在降低神經(jīng)炎癥及iNOS表達(dá)的同時，完全阻止了TH含量的下降。一氧化氮對酪氨酸羥化酶含量的調(diào)控機(jī)制值得進(jìn)一步探究。

神經(jīng)元應(yīng)激后細(xì)胞能量缺失是PD神經(jīng)細(xì)胞死亡的最重要原因之一[32]，流行病學(xué)調(diào)查顯示經(jīng)常接觸魚藤酮、百草枯等殺蟲劑、除草劑的工人更容易患帕金森癥，其中重要的原因就是此類神經(jīng)毒劑可以直接影響中腦神經(jīng)元的線粒體呼吸鏈功能，導(dǎo)致線粒體膜電位下降、細(xì)胞產(chǎn)能障礙[33]。我們的實驗結(jié)果表明，魚藤酮本身就能下調(diào)線粒體膜電位(圖6)，單獨(dú)的NO也能降低線粒體膜電位，而NO與魚藤酮聯(lián)合處理組對神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位的下調(diào)效果最顯著，可將PD發(fā)病過程的線粒體損傷作用放大，更容易檢測到相關(guān)損傷指標(biāo)或細(xì)胞信號機(jī)制。

α-突觸核蛋白的過量表達(dá)及無序纏結(jié)是造成PD病理中路易小體形成的最主要因素，也是PD病變中區(qū)別于其他神經(jīng)退行性疾病的最顯著指標(biāo)之一[1]。我們檢測了不同處理條件對細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白含量的影響，發(fā)現(xiàn)魚藤酮組能顯著增加α-突觸核蛋白含量，NO增加該蛋白的作用更強(qiáng)，而NO與魚藤酮聯(lián)合處理組使α-突觸核蛋白含量達(dá)到最大增幅(圖7)，使PD病變中的α-突觸核蛋白指標(biāo)改變得到更顯著的體現(xiàn)。Giuliano等報道，NO可對α-突觸核蛋白進(jìn)行硝基化修飾，使得胞內(nèi)顯微纏結(jié)加劇，促進(jìn)細(xì)胞損傷[4,34]，但是NO如何調(diào)節(jié)α-突觸核蛋白的含量尚有待于進(jìn)一步研究。

蛋白質(zhì)巰基亞硝基化修飾是NO介導(dǎo)PD神經(jīng)元病變的重要途徑，可以通過可逆性修飾Parkin、PDI、XIAP等靶點誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡[16]。我們在之前的研究中報道了使用一氧化氮供體GSNO對神經(jīng)細(xì)胞中經(jīng)典靶點的亞硝基化修飾[35]，在魚藤酮和NO聯(lián)合處理的SH-SY5Y細(xì)胞中，我們也檢測到相關(guān)蛋白質(zhì)的SNO修飾(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，表明使用聯(lián)合誘導(dǎo)模型可以對PD模型中蛋白質(zhì)亞硝基化修飾的功能開展研究。

綜上所述，一氧化氮的加入使魚藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中的多項指標(biāo)更加趨近PD病理性神經(jīng)元損傷，是對魚藤酮建立的PD細(xì)胞模型的有益補(bǔ)充。此外，NO供體與魚藤酮聯(lián)合處理神經(jīng)細(xì)胞的模型也為研究NO在PD病變中的作用提供了有力的工具。