汪曉曼，朱怡恬，葉莉莉，蘇亞娟

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/南京市婦幼保健院檢驗(yàn)科,江蘇南京 210009;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科,黑龍江哈爾濱 150081

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的常見惡性腫瘤，全世界每年新增病例約138萬(wàn)，近年其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，世界衛(wèi)生組織公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已成為全球女性的首發(fā)惡性腫瘤[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，早期乳腺癌預(yù)后較好，但晚期乳腺癌因發(fā)生淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，因此，乳腺癌的早期診斷對(duì)提高乳腺癌的療效、改善預(yù)后具有重要意義[2-3]。乳腺癌的診斷臨床常采用活組織檢測(cè)，但因其具有侵入性、存在取樣誤差和患者依從性差等缺點(diǎn)難以開展[4]。目前血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)已成為乳腺癌早期診斷的重要輔助手段之一，受到臨床的廣泛重視，且每一種腫瘤標(biāo)志物都有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和局限性，合理利用能優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提高乳腺癌的診斷率[5]。本研究對(duì)血清中非編碼小RNA分子miR-21、可溶性細(xì)胞間黏附分子1(sICAM-1)和糖類抗原153(CA153)聯(lián)合檢測(cè)在乳腺癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年12月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院診斷為乳腺癌的患者31例作為惡性腫瘤組，年齡35～77歲，平均(53.13±4.65)歲，術(shù)后病理TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期9例，Ⅲ期13例，Ⅸ期2例。選擇同期在南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院活組織檢測(cè)為乳房良性病變患者31例作為良性腫瘤組，年齡37～79歲，平均(54.16±4.92)歲；選擇同期在南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院體檢健康者31例作為健康對(duì)照組，年齡36～76歲，平均(52.48±5.27)歲。3組受試者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 血清CA153檢測(cè)采用瑞士羅氏e601電化學(xué)發(fā)光微粒子儀及匹配的試劑，以上項(xiàng)目通過室間質(zhì)評(píng)及性能驗(yàn)證；血清sICAM-1檢測(cè)試劑盒由CUSABIO公司提供。RNA提取試劑盒由美國(guó)Invitrogen公司提供，SYBR Green熒光染料試劑盒購(gòu)自瑞士羅氏公司，PCR引物由上海昕浩生物設(shè)計(jì)、合成。

1.3方法

1.3.1血清標(biāo)本的分離 所有患者抽取空腹靜脈血5 mL，室溫靜置20 min，以3 000 r/min離心20 min進(jìn)行血清分離，于-20 ℃冰箱保存，所有標(biāo)本避免脂血、溶血和黃疸。

1.3.2血清CA153和sICAM-1檢測(cè) 血清CA153的檢測(cè)采用電化學(xué)發(fā)光微粒子法，血清sICAM-1的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法。以上各指標(biāo)的檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書及《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版[6]進(jìn)行。

1.3.3血清miR-21檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清miR-21水平。采用苯酚氯仿法提取血清中總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green法檢測(cè)血清miR-21水平，上游引物5′-TGC GGT AGC TTA TCA GAC TG-3′，下游引物5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。反應(yīng)體系：MgCl21.20 μL，PCR緩沖液2.00 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.40 μL,Taq酶0.30 μL，探針和引物0.33 μL，cDNA 1.00 μL，加ddH2O至總反應(yīng)體積20.00 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)以ddH2O 設(shè)為陰性對(duì)照。

1.3.4計(jì)算公式 靈敏度=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陰性)×100%，特異度=真陰性/(真陰性+假陽(yáng)性)×100%，陰性預(yù)測(cè)值=真陰性/(真陰性+假陽(yáng)性)×100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陽(yáng)性)×100%，診斷效率=真陽(yáng)性+真陰性/(真陽(yáng)性+假陽(yáng)性+真陰性+假陰性)×100%。

2 結(jié) 果

2.13組血清miR-21、sICAM-1、CA153水平比較 血清miR-21、sICAM-1、CA153水平在良性腫瘤組與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.261、1.319、1.685，均P>0.05)；血清miR-21、sICAM-1、CA153水平在惡性腫瘤組明顯高于良性腫瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.876、2.651、5.394，均P<0.05)。見表1。

表1 3組血清miR-21、sICAM-1、CA153水平比較

2.23種生物學(xué)標(biāo)志物單項(xiàng)或聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌的早期診斷效能 本研究數(shù)據(jù)顯示，血清miR-21、sICAM-1、CA153聯(lián)合檢測(cè)早期診斷乳腺癌的靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和診斷效率與miR-21單項(xiàng)檢測(cè)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.383、6.653、4.391，均P<0.05)；血清miR-21、sICAM-1、CA153聯(lián)合檢測(cè)早期診斷乳腺癌的靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和診斷效率與sICAM-1單項(xiàng)檢測(cè)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.715、4.310、5.922、4.257，均P<0.05)；血清miR-21、sICAM-1、CA153聯(lián)合檢測(cè)早期診斷乳腺癌的靈敏度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和診斷效率與CA153單項(xiàng)檢測(cè)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.715、6.945、5.107、12.37、7.461，均P<0.05)。見表2。

分別繪制血清miR-21、sICAM-1、CA153單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌早期診斷的ROC曲線，結(jié)果顯示，miR-21、sICAM-1、CA153單項(xiàng)檢測(cè)早期診斷乳腺癌的ROC曲線下面積分別為0.739(95%CI：0.604～0.874)、0.723(95%CI：0.591～0.854)、0.767(95%CI：0.633～0.902)，而血清miR-21、sICAM-1、CA153聯(lián)合檢測(cè)早期診斷乳腺癌的ROC曲線下面積為0.891(95%CI：0.792～0.991)。見圖1。

表2 3種生物學(xué)標(biāo)志物單項(xiàng)或聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌的早期診斷效能(%)

圖1 血清miR-21、sICAM-1、CA153單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)早期診斷乳腺癌的ROC曲線

3 討 論

近年來(lái)隨著生命科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，一類在進(jìn)化上高度保守、在基因轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)負(fù)向調(diào)控基因的miRNA的研究在各個(gè)領(lǐng)域最為活躍，極大拓寬了人們對(duì)生物發(fā)育、疾病發(fā)生、發(fā)展的認(rèn)識(shí)[7]。在哺乳動(dòng)物基因組中，成熟的miRNA基因調(diào)控著超過30%的基因表達(dá)或蛋白合成[8]，因此,miRNA 在不同疾病及病理進(jìn)程中具有特定的表達(dá)譜，已經(jīng)在多種腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥等多種疾病的診斷和預(yù)后中顯示了重要價(jià)值[9]。miRNA不僅在組織中穩(wěn)定表達(dá)，并且在血清中具有較高的穩(wěn)定性和特異度，因此，有望成為早期診斷腫瘤的無(wú)創(chuàng)新型生物學(xué)標(biāo)志物[10]。

多種惡性癌組織中miRNA的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，miR-21作為miRNA中研究的熱門原癌基因，被視為一種理想的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物[11]。miR-21已被發(fā)現(xiàn)在多種血液系統(tǒng)和實(shí)體器官的惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，是目前唯一發(fā)現(xiàn)的在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和食管癌中均高表達(dá)的miRNA，也是第一個(gè)可以在腫瘤患者血清中檢測(cè)到的miRNA，因此，在miRNA的研究領(lǐng)域中，miR-21的作用不容忽視[12]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，miR-21在乳腺癌早期患者血清中顯著升高，提示miR-21在乳腺癌的早期診斷中具有一定的臨床價(jià)值，且相對(duì)于早期乳腺癌患者，晚期患者miR-21升高更為顯著，因此，miR-21與乳腺癌的臨床分期密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，miR-21在惡性腫瘤組均明顯高于良性腫瘤組。但基于miR-21表達(dá)具有廣譜性，將miR-21單項(xiàng)檢測(cè)用于乳腺癌早期診斷，特異度較低，因此，本研究將miR-21與sICAM-1、CA153聯(lián)合檢測(cè)，以提高臨床對(duì)于乳腺癌早期診斷的特異度。sICAM-1作為介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的黏附分子，與其配體結(jié)合可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與不同細(xì)胞、基質(zhì)的黏附，以此促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究顯示，sICAM-1在肝癌組織中表達(dá)顯著增加，水平與腫瘤的大小、包膜的完整性密切相關(guān)，且有轉(zhuǎn)移組sICAM-1水平顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移組，sICAM-1已作為預(yù)測(cè)肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)[14]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，sICAM-1在乳腺癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性率明顯高于相應(yīng)的正常乳腺組織[15]，與本研究對(duì)sICAM的檢測(cè)結(jié)果高度一致，提示本研究選擇將sICAM-1作為乳腺癌早期診斷的指標(biāo)之一切實(shí)可行。CA153作為公認(rèn)的乳腺癌相關(guān)抗原，不僅用于乳腺癌的監(jiān)測(cè)和篩查，還可作為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移及預(yù)后的標(biāo)志物[16]，但單獨(dú)將CA153作為乳腺癌早期診斷的標(biāo)志物尚存在片面性。因此，本研究將血清miR-21、sICAM-1、CA153聯(lián)合檢測(cè)用于乳腺癌的早期診斷，其靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、診斷效率較單項(xiàng)檢測(cè)均顯著提高，分別為87.1%、90.3%、93.3%、81.8%、89.2%，且聯(lián)合檢測(cè)早期診斷乳腺癌的ROC曲線下面積為0.891，說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌的早期診斷有重要臨床價(jià)值。本研究不足之處在于納入的樣本量相對(duì)較少，后續(xù)研究中，將采取前瞻性研究，擴(kuò)大臨床樣本量，進(jìn)一步確定適合本地區(qū)特色的乳腺癌早期診斷模式。