葛 翎，路 露，周 謙，張秋生，蔡 波，黃曉德，張峰倫，錢 雪，李海濤*，陳 斌*，曹 鵬

(1. 南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023； 2. 南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211100；3. 南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇 南京 210028； 4. 廣州棟方生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510800；5. 廣州奧蓓斯化妝品有限公司，廣東 廣州 510800)

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)，又名馬舌菜、長命菜，是中國衛(wèi)生部和世界衛(wèi)生組織指定的天然藥食同源物[1]，常以根莖入藥。馬齒莧對氣候、土壤等生存環(huán)境條件適應性極強，幾乎可以在任何土壤上生存[2]。研究表明其具有抗炎[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]等多種生物學活性，在臨床上常用于痢疾、腸炎治療。這些功效及活性主要與其含有豐富的黃酮類、多糖類、生物堿類物質有關[6-7]。

目前，馬齒莧資源的利用僅限食用及簡單藥用，而其實用價值研究主要集中在植物培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化[8]、提取工藝改進[9]及多糖類和生物堿類成分抗腫瘤、抗氧化機制研究[10]等方面，而在抗敏、修復肌膚屏障、降脂、降糖等方面研究較少，并且甚少涉及資源開發(fā)及產(chǎn)品應用。同時，相關研究表明馬齒莧水提物能夠通過作用于血管內皮的α-受體，抑制毛細血管通透性，減輕炎癥反應，緩解過敏癥狀，加速上皮細胞的生理功能恢復，促進潰瘍的修復、愈合[11-12]，可以作為一種抗敏修復藥應用在皮膚病治療中。動物試驗[13]表明馬齒莧能夠改善高脂血癥，防止脂質沉積，調節(jié)脂質代謝。因此，本試驗通過對馬齒莧醇提物(PortulacaoleraceaL. ethanol extract，POEE)進行安全性、生物活性評價，以期為其在醫(yī)藥、護膚品行業(yè)深層次應用提供數(shù)據(jù)支撐并為該領域提供天然的植物原料。

1 試劑與儀器

1.1 試驗材料

馬齒莧(中國北京同仁堂有限公司)；大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)均由南京野生植物綜合利用研究院提供。

1.2 試劑

透明質酸酶、酪氨酸酶(Aladdin試劑有限公司)；α-葡萄糖苷酶(上海瑞永生物科技有限公司)；氫氧化鈉、無水氯化鈣、無水乙酸鈉、冰乙酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等(國藥集團化學試劑有限公司)；L-左旋多巴(美國Abcam公司)；透明質酸鈉(華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司)；對二甲氨基苯甲醛(上海Macklin科技有限公司)。

1.3 試驗儀器

722E型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；HZQ-F160型全溫度震蕩培養(yǎng)箱(太倉華美生化儀器廠)；DFT-1000型高速萬能打粉機(溫嶺市林大機械有限公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；BSA224S型電子分析天平(北京楚齊儀表有限責任公司)。

2 試驗方法

2.1 馬齒莧醇提液制備工藝

用高速粉碎機將馬齒莧藥材進行粉碎，過40目篩，最后將過完篩的馬齒莧粉末置于干燥器中密封保存，備用。

稱取馬齒莧粉末100 g，料液比1:15(g/mL)，提取溫度為50℃，乙醇濃度為70%，時間為53 min，后過濾，濾液旋蒸至一定體積，并干燥至恒重，得到馬齒莧醇提物，按試驗所需質量濃度配置成一定質量體積濃度的醇提取物溶液[14-15]。

2.2 最小抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)測定

參考王玲等[16]的方法，采用試管倍比稀釋法測定最小抑菌濃度(Minimal inhibition concentration，MIC)，用二甲亞砜將樣品稀釋成200、100、50、25、12.5、6.25 mg·mL-1溶液備用。取1 mL液體培養(yǎng)基、500 μL不同濃度樣品和500 μL菌懸液(1×108CFU/mL)，加入到試管中，充分混勻。試管置于37℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。以含有二甲亞砜的液體培養(yǎng)基和菌液的試管為陰性對照。觀測其MIC值，平行試驗3次，取平均值。確定MIC后，測定最小殺菌濃度(Minimal fungicidal concentration，MBC)[17]，將有效抑菌濃度藥液移種、均勻涂布至空白的馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿放置在37℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。觀察培養(yǎng)基上有無菌體生長，以培養(yǎng)皿中計數(shù)減少原始菌落的99.9%的馬齒莧醇提物的濃度為最小殺菌濃度。平行試驗3次，取平均值。

2.3 透明質酸酶抑制試驗

對Elson-Morgan法進行改進、測定[18-19]，配置質量濃度分別為20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg·mL-1POEE。取0.25 mmol·L-1CaCl2溶液0.1 mL和0.5 mL透明質酸酶37℃水浴鍋保溫20 min；取出后每組加入POEE 0.5 mL，繼續(xù)37℃保溫20 min；加入0.5 mL透明質酸鈉液37℃水浴鍋保溫40 min，常溫放置10 min；每組加入0.4 mol·L-1NaOH 0.1 mL溶液和0.5 mL乙酰丙酮(現(xiàn)配)溶液，置于沸水浴中加熱15 min后取出，立即用冰水進行冷卻15 min；加入埃爾利希試劑1.0 mL，經(jīng)充分振蕩后加入無水乙醇至8.0 mL，室溫放置20 min顯色，并用分光光度計于波長530 nm處測定其吸光值。將撲爾敏作為陽性對照品，進行對照試驗。

式中：A為對照溶液Abs值(用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液)；B為對照空白Abs值(用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液及酶液)；C為試樣溶液Abs值；D為試樣空白溶液Abs值(用醋酸緩沖溶液代替酶液)。

2.4 酪氨酸酶抑制率測試

參考劉曉英等[20]、嚴航等[21]方法改進，取馬齒莧醇提物溶于磷酸鹽緩沖液(pH=7)，稀釋成不同質量濃度的POEE，按照表1設計向試管中依次分別加入PBS、POEE和酪氨酸酶溶液(100 U/mL)，混合均勻，置于37℃水浴恒溫反應10 min，分別迅速加入0.5 mL L-左旋多巴溶液(1.5 mmol/L)，混合均勻，反應15 min，在475 nm處測定吸光值(A)，各反應組吸光值分別記作A1、A2、A3和A4，并設置熊果苷為對照。按照以下公式計算馬齒莧樣品液對酪氨酸酶的抑制率:

表1 各反應液組成Table 1 Reaction liquid composition

2.5 α-葡萄糖苷酶抑制試驗

參考楊曉軍等[22]、姜翠翠等[23]的方法進行改動，測定樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。分為樣品組、樣品對照組、陰性對照組、陰性空白對照組，POEE的濃度分別為20、40、60、80、100、200 mg·mL-1，加入的試劑按表2操作。加入不同濃度POEE與α-葡萄糖苷酶，37℃恒溫孵育15 min，再加入對硝基苯酚吡喃葡萄糖苷(P-nitrophenol glucopyranoside,PNPG)(1 mmol·L-1)37℃恒溫繼續(xù)孵育20 min后，最后加入100 μL Na2CO3(1 mol·L-1)終止液終止反應。在405 nm波長處測定吸光度，每組重復3次，同時以不同濃度阿卡波糖溶液作為陽性對照。對α-葡萄糖苷酶的抑制率按照以下公式進行計算。

式中：As為樣品組吸光值；Asc為樣品對照組吸光值；Ac為陰性對照組吸光值；Abc為陰性空白對照組吸光值。

2.6 馬齒莧醇提液安全性評價及降脂活性檢測

2.6.1 馬齒莧醇提液對動脈粥樣硬化細胞模型

Raw 264.7細胞活力的影響

參考李秀英等[24]方法，略有改動。0～200 μg·mL-1ox-LDL誘導Raw 264.7細胞成為泡沫細胞，用MTT法測定細胞增殖活性；利用ox-LDL建立動脈粥樣硬化Raw 264.7細胞模型，加入不同濃度的POEE進行干預，用MTT法測定細胞增殖活性。并設立正常藥液組(只加入不同濃度POEE)，以觀察不同濃度藥液對Raw 264.7細胞的影響。

表2 馬齒莧醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制活性測定的加樣表Table 2 Sample of the determination of α-glucosidase inhibitory activity by the POEE (μL)

2.6.2 馬齒莧醇提物對Raw 264.7細胞動脈粥硬

化模型中胞內TC和FC含量的影響

設置空白對照組、模型組、馬齒莧醇提物藥液組。適應性培養(yǎng)24 h后，換成無血清細胞培養(yǎng)液，適應性培養(yǎng)1 h。馬齒莧醇提物藥液組加入不同濃度藥液，使其終濃度分別為400、300、200、100 μg·mL-1(A～D組)，培養(yǎng)4 h后，加入造模所用ox-LDL使其終濃度為60 μg·mL-1。經(jīng)過24 h孵育，用0.25%含二胺四乙酸胰蛋白酶消化液消化后收集細胞，按照脂質測定試劑盒說明書分別檢測細胞內TC和FC含量。以80 μg·mL-1苯扎貝特為陽性對照組，每組重復4次。

3 結果與分析

3.1 最小抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)測定結果

POEE對5種菌的MIC和MBC的測定結果見表3和表4。POEE對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制效果(表3)。POEE濃度為50 mg·mL-1時，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌不生長，而金黃色葡萄球菌在濃度為100 mg·mL-1時不生長。由表可知POEE對白色念珠菌抑制效果最佳，其MIC和MBC 值分別為50、100 mg·mL-1, 對金黃色葡萄球菌抑制效果最差，MIC和MBC 值分別為100、100 mg·mL-1。

3.2 馬齒莧醇提物透明質酸酶體外抑制試驗結果

如圖1所示，POEE對透明質酸酶的抑制率隨著濃度的增大而增大，呈濃度依賴型增長。30 μg·mL-1陽性對照撲爾敏對透明質酸酶抑制率為80%，10 mg·mL-1POEE可達到80%，由此可知POEE具有顯著的抗敏活性。

表3 最小抑菌濃度結果Table 3 Results of minimum inhibitory concentration

表4 馬齒莧醇提物對5種菌種的最低抑菌濃度和最小殺菌濃度Table 4 Minimum inhibitory concentration and minimumbactericidal concentration of the POEE against 5 species of bacteria

圖1 透明質酸酶抑制結果Fig. 1 Hyaluronidase inhibition rates of the POEE

3.3 酪氨酸酶抑制率測試結果

由表5可知，在2.5～20 mg·mL-1濃度范圍內，POEE和熊果苷對酪氨酸酶的抑制率成正比。當POEE濃度為20 mg·mL-1時，對酪氨酸酶的抑制率高達76.71%，其抑制率是同等濃度熊果苷的1.25倍。表明馬齒莧可以成為一種有效且對人體無毒副作用的天然酪氨酸酶抑制劑。

表5 馬齒莧醇提物對酪氨酸酶的抑制效果Table 5 Inhibitory effect of the POEE on tyrosinase

3.4 α-葡萄糖苷酶抑制試驗結果

由圖2可知，POEE濃度在20～200 mg·mL-1范圍內對α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈正相關作用。當其濃度為200 mg·mL-1時，α-葡萄糖苷酶抑制率達49%，其抑制效果接近于阿卡波糖(200 mg·mL-1)，說明馬齒莧具有潛在的降糖功效。

3.5 馬齒莧醇取物改善動脈粥樣硬化相關指標

細胞試驗結果如圖3所示，與模型組相比，POEE在100～400 μg·mL-1濃度內，對細胞增殖活力無顯著影響，具有顯著安全性(p<0.05)。在安全給藥濃度下，300 μg·mL-1POEE能夠最好保護被60 μg·mL-1ox-LDL損傷細胞，提高受損傷細胞增值活力。

圖2 不同樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig. 2 Inhibition of α-glucosidase by different samples

圖3 不同濃度馬齒莧醇提物對泡沫細胞增殖活性的影響及安全性評價Fig.3 The ratio of the POEE with different concentration to the proliferation activity of foam cells and its safety evaluation注：*P<0.05；***P<0.001；****P<0.000 1，下同

如圖4所示，表明馬POEE能夠降低Raw 264.7細胞動脈粥樣硬化模型中胞內總膽固醇及游離膽固醇含量，降低細胞內脂質含量，延緩動脈粥樣硬化進程，其效果與80 μg·mL-1苯扎貝特沒有顯著差異(P<0.05)。

4 討 論

馬齒莧醇提物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制效果，這與翟興禮[25]的研究結果相似。抑菌效果證實與提取物濃度有相關性，但對不同菌種有差異性。其中對白色念珠菌抑制效果最佳，對金黃色葡萄球菌抑制效果最差，這可能是由于其醇提物成分抑制真菌能力較強。谷春梅等[26]研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧提取物中黃酮的抑菌順序為：酵母菌>黑曲霉>大腸桿菌，這也進一步表明馬齒莧提取物對真菌的抑制效果強于細菌。

圖4 各組細胞內TC/FC比較Fig. 4 Comparison of TC/FC in each group

目前，在洗護用品檢測中常見的的抗過敏試驗方法有透明質酸酶體外抑制試驗、肥大細胞組胺釋放試驗、被動皮膚過敏試驗和毛細血管通透性試驗等[27]。其中，透明質酸酶體外抑制試驗是一種與過敏具有強相關性的測定方法。本試驗表明POEE對透明質酸酶的抑制呈現(xiàn)出良好的量效關系，這可能是由于醇提物含有黃酮、香豆素、生物堿等非極性物質[28]，這些有效成分對透明質酸酶活性有顯著抑制作用。此外，胡一梅[29]的動物試驗也證實馬齒莧醇提液對急性濕疹具有緩解治療作用，其機制可能是通過抑制毛細血管通透性，抑制炎性腫脹，從而減輕濕疹局部的瘙癢、水腫癥狀。由此也驗證了馬齒莧提取液具有顯著的抗敏活性。

酪氨酸酶是普遍存在于人體內對黑色素生物合成過程中起關鍵作用的酶，抑制酪氨酸酶活性是目前評價植物天然成分美白功效的標準之一[30]。POEE對酪氨酸酶具有明顯抑制效果，且呈濃度依賴性，具有美白作用，這與張理平等[31]的研究結果一致。這可能是由于POEE中的酸性成分具有抑制酪氨酸酶活性的作用[32]。其可能作用機制是通過與酪氨酸酶的結合，競爭性占據(jù)多巴的結合位點，促進黑色素的分解從而有效地抑制皮膚中酪氨酸酶活性，減少皮膚色素沉積。

在降糖功效研究方面，POEE濃度對α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈正相關關系，可競爭性抑制α-葡萄糖苷水解酶。其良好的降糖效果表明可以將其開發(fā)成一種天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑。天然產(chǎn)物中的α-葡萄糖苷酶的抑制會影響碳水化合物在小腸上部的吸收，降低糖尿病人餐后高血糖水平，預防因血糖波動引發(fā)的心血管疾病等[33]。然而長期服用會引發(fā)消化系統(tǒng)紊亂等副作用[34]。因此，需要精確控制產(chǎn)品用量。

血脂過高是導致動脈粥樣硬化的重要因素，大量含脂質的泡沫細胞是初期病變的特征性表現(xiàn)。因此，降低細胞內脂質堆積，減輕巨噬細胞泡沫化成為防治動脈粥樣硬化的重要手段[35-38]。動物試驗[39]結果顯示富含不飽和脂肪酸的馬齒莧可降低家兔血清中 TC、TG、LDL-C含量，升高HDL- C含量水平，提高機體抗自由基作用，減少丙二醛的形成，從而達到抗動脈粥樣硬化形成、預防心血管疾病的作用。POEE對脂質代謝紊亂的調節(jié)作用，一方面可能是因為馬齒莧含有豐富的ω-3不飽和脂肪酸，其作為一種膽固醇的特殊轉運載體，能夠將膽固醇轉運到血管外周組織代謝，防止過多膽固醇沉積于血管壁內，從而緩解動脈粥樣硬化[40]。另一方面，馬齒莧含大量抗氧化作用的有效成分，能提高機體抗自由基作用，減少丙二醛的形成，從而逆轉動脈粥樣硬化形成、預防心血管疾病[41]。

5 結 論

本試驗對馬齒莧的生物活性進行了測定，結果表明POEE可以作為一種安全無刺激的天然防腐劑添加到化妝品中，從而降低化學抑菌劑和防腐劑在護膚品中的應用。同時，POEE能夠減輕或抑制常見致敏源對皮膚的刺激作用、增強皮膚的屏障功能，表現(xiàn)了其在美白和抗過敏方面的功效，可以作為美容產(chǎn)品中美白和抗過敏作用的原料來源。另一方面，POEE對α-葡萄糖苷酶的抑制作用、對動脈粥樣硬化細胞模型中泡沫細胞增殖活力及細胞內TC、FC的抑制作用，表明馬齒莧在降血糖、降血脂方面具有良好功效，可作為潛在的保健品原料或添加劑。

通過POEE在抑菌、抗敏、美白、降糖、降脂等方面的試驗研究，為馬齒莧在除食用之外作為一種多功效的原料應用到更廣泛領域的應用提供參考。