馬紅梅，盤(pán)玉蘭，彭一鑫，黃 海

(海南熱帶海洋學(xué)院 a.熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;c.水產(chǎn)與生命學(xué)院，海南 三亞 572022 )

0 引言

隨著塑料在人們生活中使用的增多，越來(lái)越多的塑料垃圾通過(guò)河流等途徑進(jìn)入海洋，它們隨著風(fēng)浪、洋流、動(dòng)物攝食等方式進(jìn)入全球海域，影響著全球海洋生態(tài)系統(tǒng)。人們對(duì)海洋塑料的污染也越來(lái)越重視。目前相關(guān)研究主要聚焦在海洋塑料的分布、數(shù)量、鑒定及對(duì)生物和生態(tài)系統(tǒng)的影響等方面。由于高通量測(cè)序的發(fā)展，關(guān)于海洋塑料微生物菌群的研究也逐漸增多[1]。在微生物菌群研究中，可以利用常規(guī)分離純化技術(shù)分析樣品中可培養(yǎng)的菌群關(guān)系，但實(shí)驗(yàn)操作煩瑣、耗時(shí)，而高通量測(cè)序技術(shù)則可在較短時(shí)間內(nèi)分析某一樣品中所有可培養(yǎng)與不可培養(yǎng)的菌群。目前，高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛運(yùn)用于發(fā)酵魚(yú)樣品中細(xì)菌菌系組成分析，同時(shí)還應(yīng)用于海洋沉積物、海水以及海洋生物腸道中的微生物菌群分析[2-4]。微生物菌群結(jié)構(gòu)特征是其生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，也是認(rèn)識(shí)和解決環(huán)境問(wèn)題的有效切入點(diǎn)。通過(guò)高通量測(cè)序，不僅可了解環(huán)境樣品中群落的組成及群落豐度，還能分辨出環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌群等[5]。

本研究分析了三亞灣潮間帶塑料表面附著細(xì)菌菌群，旨在豐富我國(guó)熱帶地區(qū)海洋塑料菌群研究的數(shù)據(jù)，為研究塑料表面附著菌群對(duì)海洋環(huán)境的影響及對(duì)周邊環(huán)境的響應(yīng)提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 材料

在三亞灣潮間帶選間隔1 000 m的2個(gè)點(diǎn)(E 109°49′84″，N18°25′43″和E18°24′63″，W109°50′08″)，并在2點(diǎn)周?chē)?00 m范圍內(nèi)取樣，每個(gè)點(diǎn)分別取泡沫、漁網(wǎng)、塑料(食品包裝袋等多種塑料)3個(gè)不同樣本各1個(gè)，共6個(gè)樣本。取樣材質(zhì)分別為泡沫(PS)、漁網(wǎng)線(PP)、食品包裝袋(PE)、尼龍繩(PA)。按采樣點(diǎn)及材質(zhì)不同分為2組，其中：樣品分組1(A)為泡沫(1_1PM)、漁網(wǎng)線(1_2YW)及食品包裝袋、尼龍繩等可見(jiàn)塑料(1_3SL)；樣品分組2(B)為泡沫(2_1PM)、漁網(wǎng)線(2_2PM)及食品包裝袋、尼龍繩等可見(jiàn)塑料(2_3SL)。在樣品采集前，先將所需的實(shí)驗(yàn)器皿置于121 ℃高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌。在退潮期間，用無(wú)菌鑷子在2個(gè)點(diǎn)獲取潮間帶塑料樣品，并將樣品放入準(zhǔn)備好的無(wú)菌瓶中，立即置于所攜帶的裝滿(mǎn)冰袋的箱中冷凍保存。

1.2 儀器

移液器(Eppendorf ，德國(guó))，電子恒溫不銹鋼水浴鍋(HHS-2S ，上海)，Eppendorf離心機(jī)(Eppendorf ，德國(guó))，電泳儀和凝膠成像儀(Bio Rad ，美國(guó))，ABI9700 PCR儀(ABI ，美國(guó))，F(xiàn)TC-3000TM real-time PCR(楓嶺 ，上海)，Qubit 3.0 Fluorometer(Thermo Fisher，美國(guó))，Miseq測(cè)序儀(Illumina ，美國(guó))。

1.3試劑

PBS buffer(捷瑞，上海)，RNA酶(捷瑞，上海)，蛋白酶K(merck，德國(guó))，SDS(生工，上海)，酚氯仿異戊醇(捷瑞，上海)，無(wú)水乙醇(捷瑞，上海)，NaAC(上海 ，捷瑞)，糖原(上海，捷瑞)，Phusion 超保真 DNA 聚合酶(NEB，英國(guó))，DNA Marker(DL9000 欣百諾；DL2000 Takara)，Axygen 凝膠回收試劑盒(Axygen，美國(guó))，Qubit ds DNA BR Assay Kit(Thermo Fisher，美國(guó))，TB Green Premix Ex Taq(Takara ，日本)，MiSeq Reagent Kits v3(Illumina ，美國(guó))。

1.4高通量測(cè)序

樣品DNA采用蛋白酶K裂解法進(jìn)行抽提[6]，并分別取3 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。選取原核生物16s rDNA基因的 V4～V5區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序分析。利用通用引物5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，926R 5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′進(jìn)行2步PCR擴(kuò)增，每次擴(kuò)增都取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN USA)進(jìn)行回收，并用FTC-3000TM Real-Time PCR儀(楓嶺，上海)對(duì)膠回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量測(cè)定，完成文庫(kù)構(gòu)建后，采用Illumina Miseq Regent V3 kit對(duì)該產(chǎn)物在微基生物科技(上海)有限公司完成測(cè)序。

對(duì)測(cè)得的原始數(shù)據(jù)通過(guò)barcode分配樣品reads，得到每個(gè)樣本的有效序列，采用Trimmomatic (Version 0.35)、Flash(Version 1.2.11)和mothur(Version 1.33.3) 3個(gè)軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行選擇、拼接、質(zhì)控及過(guò)濾，去除嵌合體后得到優(yōu)化序列[7]。

1.5 基于序列相似性聚類(lèi)OTU分析

采用UPARSE 軟件進(jìn)行OTU(operational taxonomic unit，分類(lèi)操作單元) 聚類(lèi)，所得的OTU代表序列信息與Silva 128數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后得到物種信息注釋。得到分類(lèi)學(xué)信息后，在門(mén)、綱、目、科、屬、種分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，在97%相似度水平下利用R語(yǔ)言(Version 3.4.1)進(jìn)行稀釋曲線、豐度等級(jí)曲線、VENN圖、PCA和群落結(jié)構(gòu)柱形圖等的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

1.6 物種分類(lèi)學(xué)分析

將所獲得的物種分類(lèi)信息利用 R(3.4.1)語(yǔ)言 ggplot 2對(duì)其在門(mén)、綱、目、科、屬、種分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的信息匯總，并在EXCEL匯總表格上做每個(gè)水平上的群落結(jié)構(gòu)柱狀圖，觀察樣品在不同分類(lèi)水平上的群落結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于序列相似性聚類(lèi)OTU分析

從圖 1可知，2次電泳的電泳條帶單一，長(zhǎng)度符合預(yù)期，負(fù)對(duì)照無(wú)污染，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由高通量測(cè)序結(jié)果的OTU聚類(lèi)分析表明，共有1 890個(gè)OTU序列分析出不同的菌。用相應(yīng)數(shù)據(jù)構(gòu)建稀釋曲線(Rarefaction Curve)，它是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體，統(tǒng)計(jì)這些個(gè)體所代表的物種數(shù)目，并以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建曲線(圖 2)。

圖1 PCR擴(kuò)增電泳圖 注：左圖為1次PCR擴(kuò)增，右圖為第2次PCR擴(kuò)增；圖中數(shù)字1～6分別對(duì)應(yīng)樣品為1_1PM、1_2YW、1_3SL、2_1PM、2_2YW 、2_3SL ；P代表PBS抽提空白試劑對(duì)照；M為DL2000，分子量大小從上至下依次是2 000，1 000，750，500，250，100 bp。

2.2高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的處理

從圖2可知，稀釋曲線趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序深度足夠、測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。根據(jù)每一個(gè)OTU所含的序列數(shù)，將OTUs按豐度(指所含有的序列條數(shù))由大到小等級(jí)排序，再以O(shè)TU等級(jí)為橫坐標(biāo)，以每個(gè)OTU中所含的序列數(shù)(也可用OTU中序列數(shù)的相對(duì)百分含量)為縱坐標(biāo)作豐度等級(jí)圖(圖3)。從圖3可知，除樣本1_3SL外，其他樣本的相對(duì)豐度及均勻度都相似。而1_3SL與另外5個(gè)樣本的OTU相比，豐度低，均勻度高，說(shuō)明1_3SL群落結(jié)構(gòu)中微生物種類(lèi)比其他樣品低，但1_3SL中各物種數(shù)量均勻度高。

圖2 樣品稀釋曲線 圖3 樣品豐度等級(jí)

在統(tǒng)計(jì)的6個(gè)樣本中，利用共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目制作Venn圖，用它觀察各樣本間的相似性及重疊情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可知，樣品中共有的 OTU有577個(gè)，1_1PM，1_2YW，1_3SL，2_1PM，2_2YW，2_3SL各自獨(dú)有的OTU 數(shù)分別為 27，38，36，50，17，33。2_1PM樣品中獨(dú)有的 OTU 數(shù)最多，有50個(gè)，說(shuō)明在6個(gè)樣本中2_1PM特有的菌群微生物種類(lèi)最多，圖4中心的數(shù)字577表明各樣本中都含有這577個(gè)OTU，它是本次測(cè)樣的核心微生物組。

通過(guò)分析不同樣品 OTU(97%相似性)組成可以反映樣品間的差異和距離，并利用數(shù)據(jù)表中信息進(jìn)行OTU的主成分分析(PCA)，該法可以有效地找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu)，去除噪音和冗余，將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，揭示隱藏在復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)。PCA 通過(guò)運(yùn)用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸選取能夠最大反映方差值的2個(gè)特征值。如樣品組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近(圖5)。由圖5可知，取樣不同地點(diǎn)的A組和B組無(wú)明顯的分組聚集，且同一種塑料材質(zhì)如1_1PM與2_1PM、1_2YW與2_2PM表現(xiàn)為兩兩距離接近，這表明距離取樣地點(diǎn)近的塑料樣品中的菌群組成差異較小，且同材質(zhì)塑料樣品中的菌群組成更相似，而塑料1_3SL和2_3SL因所含塑料種類(lèi)及材質(zhì)差異較大，不做比較。

圖4 樣品Venn圖 圖5 樣品PCA分析

2.3 物種分類(lèi)學(xué)分析

根據(jù)群落結(jié)構(gòu)柱狀圖，先從門(mén)分類(lèi)水平對(duì)樣品中物種分類(lèi)信息數(shù)據(jù)表進(jìn)行分析(圖6)。從圖6可知，采樣表面附著微生物菌群分布于28個(gè)菌門(mén)，其中平均豐度最高的5個(gè)菌門(mén)依次為變形菌門(mén)(Proteobacteria)，所占比例大于59.1%、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)，所占比例大于17.5%、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)，所占例大于7.5%、放線菌門(mén)(Actinobacteria)，所占比例大于4.8%、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)，所占比例大于3.2%。在泡沫/漁網(wǎng)/塑料分組比較中，只有2_2YW漁網(wǎng)組有互養(yǎng)菌門(mén) (Synergistetes)，異域菌門(mén)(Peregrinibacteria)只在2_3SL塑料組，漁網(wǎng)組沒(méi)有衣原體門(mén)(Chlamydiae)和儉菌總門(mén)(Parcubacteria)，泡沫組沒(méi)有螺旋體門(mén)(Spirochaetae)，但A組與B 組在門(mén)分類(lèi)水平上，樣品所含菌類(lèi)差異不大。

根據(jù)門(mén)分類(lèi)水平上群落組成結(jié)構(gòu)結(jié)果分析可知，變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為三亞灣潮間帶塑料表面附著優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，這與他人對(duì)不同地方的塑料附著菌群的研究結(jié)果一致[8-9]。De Tender等的研究表明，α-變形菌和γ-變形菌為生物膜內(nèi)微生物群落的核心物種，并可根據(jù)它來(lái)劃分生物膜的形成階段[10-11]。

在菌門(mén)平均豐度最高的5個(gè)菌門(mén)中，選取浮霉菌門(mén)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浮霉菌門(mén)在本次采樣中的豐度排在第3位，這與陳濤對(duì)暴露在煙臺(tái)養(yǎng)馬島不同深度海水中的PE表面附著菌群的分析結(jié)果基本一致[12]。舒青龍[13]對(duì)中國(guó)南海及西太平洋中的0.1，1，3，5，7，9，11 m的7個(gè)梯度的沉積物菌群進(jìn)行分析，其結(jié)果表明浮霉菌存在于5 m以上的有限層中。據(jù)此猜測(cè)，本次樣品中浮霉菌門(mén)的豐度高與取樣地點(diǎn)的水層深度有關(guān)系。利用Krona軟件對(duì)浮霉菌門(mén)物種注釋結(jié)果進(jìn)行分析可知，6個(gè)樣本中，不同材質(zhì)的樣本中其浮霉菌門(mén)豐度的差異僅為1%，均存在較多的未可培養(yǎng)的微生物，如Planctomyces，Blastopirellula，Rhodopirellula，Rubripirellula，Bythopirellula和Pirellula等菌屬均為未可培養(yǎng)菌，其中，Planctomyces和Blastopirellula這2個(gè)菌屬的豐度較高，具有探索的潛質(zhì)[14]。浮霉菌門(mén)存在于海洋、河口、河流等水環(huán)境中的一小門(mén)水生細(xì)菌，按其對(duì)氧的需求，可分為厭氧菌屬(如厭氧氨氧化細(xì)菌)和好氧菌屬(如浮霉菌屬、小梨型菌屬)等，而厭氧菌屬被認(rèn)為對(duì)全球氮循環(huán)有重要意義。目前，對(duì)浮霉菌門(mén)研究較多的主要是從海洋、湖泊等環(huán)境中分離出的浮霉菌門(mén)中的好氧微生物及應(yīng)用于污水處理中的厭氧氨氧化細(xì)菌[15]。

圖6 門(mén)水平上各樣品的群落結(jié)構(gòu)組成

根據(jù)群落結(jié)構(gòu)柱狀圖，選擇屬分類(lèi)水平對(duì)樣品中物種分類(lèi)信息數(shù)據(jù)表進(jìn)行分析(圖7)。從圖7可知，豐度最高的5個(gè)屬分別為赤桿菌屬(Erythrobacter)、魯杰氏菌(Ruegeria)、雷辛格氏菌屬(Leisingera)、寬球藻屬(Pleurocapsa)和梨形菌屬(Blastopirellula)。在1_1PM和2_1PM材質(zhì)中，菌屬豐度最高的5個(gè)屬分別為Erythrobacter，Ruegeria，Pleurocapsa，Planctomyces，Gramella；在1_2YW和2_2PM材質(zhì)中，菌屬豐度最高的5個(gè)屬分別為Erythrobacter，Ruegeria，Leisingera，Luteivirga，Halomonas；在1_3SL和2_3SL材質(zhì)中，菌屬豐度最高的5個(gè)屬分別為Erythrobacter，Ruegeria，Blastopirellula，Planctomyces，Methylobacterium。由此可見(jiàn)，赤桿菌屬(Erythrobacter)和魯杰氏菌屬(Ruegeria)是不同材質(zhì)共有的豐度較高的菌屬。利用Krona軟件對(duì)不同種類(lèi)塑料材質(zhì)中共有的Erythrobacter和Ruegeria2個(gè)菌屬注釋結(jié)果進(jìn)行分析可知，不同塑料材質(zhì)附著Erythrobacter和Ruegeria豐度的差異不大，但在塑料表面附著細(xì)菌變形菌門(mén)中的豐度相對(duì)都較高，其中Erythrobacter在變形菌門(mén)中占21%，Ruegeria在變形菌門(mén)中占6%，這2種菌屬?gòu)V泛分布于海洋環(huán)境中，其中：Erythrobacter中的某些菌株的產(chǎn)物不僅具有較強(qiáng)的抑菌作用，還對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤細(xì)胞活性[16]；而Ruegeria中的某些種類(lèi)具有產(chǎn)信號(hào)分子的能力[17]，有的具有潛在合成藻青素的能力[18]，有的可抑制病原菌溶珊瑚弧菌生長(zhǎng)[19]。

圖7 屬水平上的樣品群落結(jié)構(gòu)組成

3 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序?qū)θ齺啚吵遍g帶不同點(diǎn)采集的不同塑料材質(zhì)表面附著菌群進(jìn)行分析，得出了如下結(jié)論：(1)通過(guò)高通量測(cè)序的研究方法，在三亞灣沙灘潮間帶距離較近的2個(gè)取樣點(diǎn)的塑料附著菌群不會(huì)產(chǎn)生明顯差異，同種材質(zhì)的塑料附著菌群種類(lèi)聚集相似，不同材質(zhì)的塑料會(huì)產(chǎn)生不同的菌群群落聚集。(2)在門(mén)分類(lèi)水平上，三亞灣潮間帶塑料附著菌群豐度較高的5個(gè)菌門(mén)分別為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)及藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)，其中，浮霉菌門(mén)(Planctomycetes) 的菌群豐度僅次于變形菌門(mén)(Proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)。在屬分類(lèi)水平上，豐度較高的5個(gè)菌屬分別為赤桿菌屬(Erythrobacter)、魯杰氏菌屬(Ruegeria)、雷辛格氏菌屬(Leisingera)、寬球藻屬(Pleurocapsa)及梨形菌屬(Blastopirellula)，其中，赤桿菌屬(Erythrobacter)和魯杰氏菌屬(Ruegeria)在所有采樣材質(zhì)中的豐度都較高。(3)浮霉菌門(mén)在各種水環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)，且結(jié)構(gòu)特殊，具有重要的研究?jī)r(jià)值，其中，厭氧氨氧化細(xì)菌對(duì)全球氮循環(huán)及在污水處理方面的應(yīng)用研究都有重要的意義。本研究從三亞灣潮間帶塑料中檢測(cè)到的一些不可培養(yǎng)的浮霉菌及尚未被命名的浮霉菌屬，它們具有一定的研究意義。