徐啟明，劉軍華，蘇紅英，曾海龍，劉凱東

抑郁癥是情感障礙類精神疾病之一，以心境低落、食欲減退為主要臨床表現(xiàn)。隨著時代發(fā)展，普通人群患抑郁癥比例逐年增加，因此，抑郁癥對人類健康及生命安全造成極大威脅，而應激是除遺傳因素之外誘發(fā)抑郁發(fā)生的重要機制之一。流行病學資料顯示，長期高強度心理、生理應激反應導致抑郁癥發(fā)生、發(fā)展及惡化，同時抑郁癥與心血管疾病發(fā)生密切相關，抑郁癥加重心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展[1]。本研究觀察抑郁模型大鼠心肌損傷情況及KATP通道抑制劑尼可地爾對抑郁模型大鼠心肌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 兔抗大鼠Kir6.2抗體(sc-20809)，兔抗大鼠SUR2抗體(sc-25684)，兔抗大鼠β-actin抗體(sc-130657)均購自Santa Cruz Corporation(USA)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自博士德生物(BA1054)，Tris-HCL緩沖液(pH8.8)及Tris-HCL緩沖液(pH6.8)、SDS-PAGE電泳緩沖液及轉(zhuǎn)膜緩沖液均購自北京碧云天，Nagar-Olsen染色試劑盒購自Sigma，5-羥色胺酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒購自北京碧云天，BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，i Bright高清顯色系統(tǒng)。

1.2 實驗動物 取7周齡的清潔級雄性大鼠，體重180～190 g，在23.5～24.0 ℃干燥、通風條件飼養(yǎng)大鼠1周后，隨機分為3組：對照組、慢性溫和不可預知應激(CMS)組和尼可地爾組(0.1 mg/kg)，各12只，每組大鼠分別飼養(yǎng)2周、4周、6周及8周。每周記錄1次大鼠體重及曠野實驗評分、糖水喜好實驗。

1.3 CMS誘導大鼠抑郁模型 根據(jù)參考文獻[2]將鼠籠傾斜45°放置，同時將尾部懸吊5 min，剝奪大鼠飲食及飲水，更換大鼠光照方式使其晝夜顛倒。應激實驗期每隔1周檢測大鼠體重變化，實驗結束后使用5-羥色胺試劑盒檢測腦組織5-羥色胺含量。

1.4 尼可地爾處理大鼠 將鼠籠傾斜45°放置同時將尾部懸吊5 min，剝奪大鼠飲食及飲水，更換大鼠光照方式使其晝夜顛倒。應激開始第2周使用尼可地爾0.1 mg/kg灌胃大鼠持續(xù)至應激結束，實驗期間每隔1周檢測大鼠體重變化，持續(xù)至8周實驗結束后使用5-羥色胺試劑盒檢測腦組織5-羥色胺含量。

1.5 ELISA測定CMS組大鼠下丘腦及海馬體5-羥色胺含量 將大鼠斷頭處死后置于冰盒上取出完整海馬體及下丘腦組織，置于-80 ℃保存，使用電子勻漿器充分攪拌后于4 ℃離心機以7 000 r/min離心15 min。取上清液采用ELISA分析。

1.6 大鼠心肌損傷心率與心率變異性測定 采用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)對各組大鼠進行腹腔注射麻醉，將大鼠四肢以線繩固定于木板上并取仰臥位，采用動物多導生理記錄儀及系統(tǒng)軟件記錄大鼠心率及心率變異性。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測大鼠損傷心肌KATP通道蛋白Kir6.2和SUR2表達水平

1.7.1 大鼠心肌蛋白樣品制備 取大鼠心肌組織，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次后應用電子勻漿攪拌器充分勻漿，再加入RIPA強裂解液超聲破碎7次至混合液不再黏稠為止，4 ℃條件下，以7 000 r/min離心10 min，取上層清液加入SDS-上樣緩沖液，之后沸水浴煮5 min，瞬時離心后-80 ℃保存。

1.7.2 BCA蛋白質(zhì)定量分析 按照說明書方法制作蛋白標準曲線，在96孔板中分別加入200 μL的BCA蛋白定量A液、B液混合液(50∶1)，每孔加入18 μL蒸餾水及2 μL蛋白樣品， 37 ℃條件下恒溫孵育30 min后，使用酶標儀在A562 nm處檢測蛋白濃度。

1.7.3 SDS-PAGE凝膠電泳 上樣：每孔道上樣蛋白質(zhì)量50 μg；電泳、轉(zhuǎn)模、封閉、抗體雜交：配制12%的分離膠、5%的濃縮膠及SDS-PAGE電泳緩沖液(pH7.5)，4 ℃條件下110 V恒壓電泳，采用三層夾膜濕轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。4 ℃條件下以300 mA轉(zhuǎn)膜1 h，將膜取出后使用含有5%脫脂奶粉的TBS-T溶液作為封閉液，室溫搖浴封閉2 h后在4 ℃條件下層析柜搖浴孵育一抗過夜后將條帶取出，使用TBS-T(2%Tween-20)室溫洗膜3次，每次5 min；室溫孵育二抗1 h，使用TBS-T(2%Tween-20)室溫洗膜3次，每次5 min。ECL顯色：將ECL A液與B液混合后濾膜滴加混合液，反應后于不同時間曝光后顯色。

2 結 果

2.1 大鼠腦組織5-羥色胺表達水平 與對照組比較，CMS組8周時大鼠下丘腦及海馬體組織5-羥色胺水平下降(P<0.05)；與CMS組比較，尼可地爾組大鼠下丘腦及海馬體組織5-羥色胺水平升高(P<0.05)。詳見圖1。

與對照組比較，＊ P<0.05；與CMS組比較，#P<0.05。圖1 各組大鼠下丘腦及海馬體5-羥色胺含量比較

2.2 各組大鼠心率與心率變異性變化 飼養(yǎng)2周、4周、6周和8周，與對照組比較，CMS 組大鼠各時間心率降低(P<0.05)，心率變異性升高(P<0.01)；與CMS組各時間比較，尼可地爾組大鼠心率降低(P<0.05)，心率變異性升高(P<0.01)。詳見表1。

表1 對照組、CMS組及尼可地爾組大鼠心率與心率變異性變化(±s)

2.3 各組大鼠心肌Kir6.2和SUR2表達水平比較 與對照組比較，CMS組2周、4周、6周、8周大鼠心肌細胞KATP通道(Kir6.2和SUR2亞基)蛋白表達水平升高(P<0.01)；與CMS組2周、4周、6周、8周比較，尼可地爾組大鼠心肌細胞KATP通道(Kir6.2和SUR2亞基)蛋白表達水平下降(P<0.01)。詳見圖2。

與對照組比較，＊P<0.01；與CMS組比較，#P<0.01。圖2 各組大鼠不同時間心肌KATP通道受體蛋白Kir6.2和SUR2比較 (A為心肌細胞KATP通道蛋白表達電泳圖；B為Kir6.2；C為SUR2)

3 討 論

抑郁癥是嚴重危害人類身心健康的一類精神疾病。相關研究證實，抑郁癥導致心臟疾病可能是由于機體炎癥反應促使巨噬細胞極化，促進粥樣斑塊形成及動脈粥樣硬化惡化，同時促進血小板聚集，最終導致內(nèi)皮功能及自主神經(jīng)功能障礙[2-4]。抑郁癥發(fā)生時，人體大腦產(chǎn)生的5-羥色胺及γ-氨基丁酸分泌下降，導致下丘腦-垂體-腎上腺軸功能降低，各類器官功能紊亂?，F(xiàn)代醫(yī)學認為心肌KATP通道作為一種細胞內(nèi)代謝信號感受器主要由SUR2A和Kir6.2亞基組成，心肌KATP通道開放可有效減少動作電位時程從而降低心室率和鈣離子內(nèi)流，同時抑制線粒體內(nèi)氧化自由基及活性氧產(chǎn)生，通過降低細胞凋亡與壞死水平從而增強機體對外界刺激適應性及耐受[5-8]。KATP通道開放引起心肌線粒體信號感受器過度開發(fā)，誘發(fā)線粒體外膜滲透壓增高及線粒體結構和功能損傷，最終導致線粒體能量產(chǎn)生和代謝障礙。SUR2A亞基主要表達于心肌表面，負責mRNA運轉(zhuǎn)，修復受損DNA，當機體出現(xiàn)應激、廣泛損傷、缺血缺氧時SUR2A亞基上調(diào)可提高心肌細胞攜氧能力以保護心臟免于損傷[9-10]。Kir6.2亞基是細胞膜KATP通道的一部分，Kir6.2結合ATP誘導KATP通道關閉，結合PIP2促進KATP開放，Kir6.2亞基與心腦血管疾病、糖尿病、癲癇等具有一定程度的相關性[11-12]

尼可地爾是一種KATP通道鉀離子開放劑，臨床廣泛用于治療急性冠脈綜合征，本研究證實尼可地爾對抑郁大鼠產(chǎn)生的心肌損傷具有保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)在CMS致抑郁大鼠下丘腦及海馬體5-羥色胺明顯減少，與人類發(fā)生抑郁癥時機體5-羥色胺減少類似，因此證實緩慢應激對大鼠抑郁模型建立成功，給予緩慢應激及尼可地爾(0.1 mg/kg)的大鼠下丘腦及海馬體5-羥色胺升高，具體機制將通過進一步研究證實。本研究結果還發(fā)現(xiàn)，CMS致抑郁時心率和心率變異性升高，證實緩慢應激引起心臟損傷，同時發(fā)現(xiàn)CMS組心肌KATP通道的Kir6.2亞基和SUR2亞基蛋白表達水平升高，因此推測，由于抑郁形成時心肌KATP通道發(fā)生改變，同時給予緩慢應激及尼可地爾(0.1 mg/kg)大鼠心率降低、心率變異率性改善，心肌KATP通道Kir6.2亞基和SUR2亞基蛋白表達水平下調(diào)，進而推測尼可地爾可能通過調(diào)控大鼠心肌細胞表面通道SUR2和Kir6.2亞基，誘導KATP通道開放進而降低心臟正?；顒铀璧哪芰?，最終調(diào)控心肌細胞對損傷的耐受。尼可地爾通過抑制KATP通道開放，下調(diào)Kir6.2和SUR2蛋白的表達，從而減緩抑郁大鼠發(fā)生的心肌損傷。