劉海嬌，蘇應(yīng)威，方 嵐，羅麗芬，王羅濤，張子龍，朱書生，楊 敏*

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，昆明 650201；2. 北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102466）

三七Panax notoginseng是我國特有的名貴中藥材，具有散瘀止血、消腫定痛的功效[1]。在種植過程中，三七面臨由生物和非生物因素引起的連作障礙問題，嚴重制約著三七產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[2]。眾多研究表明，作物連作障礙的發(fā)生與根際微生物密切相關(guān)，如連作使西洋參[3]、半夏[4]、丹參[5]、番茄[6]等植物根際微生物多樣性下降，而病原真菌如尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum的相對豐度增加[7]。三七連作土壤微生物類型逐漸由“細菌型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤罢婢汀笔菍е逻B作障礙發(fā)生的重要原因[8]；三年生三七根際細菌多樣性顯著低于未種植三七的對照處理[9]；還有研究發(fā)現(xiàn)，患根腐病的三七植株根際細菌多樣性顯著低于健康三七，表明根腐病的發(fā)生可能與根際細菌多樣性密切相關(guān)[10]。

土壤微生物被認為是植物的第二基因組，具有維持植物健康、促進植物生長和降解毒害物質(zhì)等重要功能[11-13]。細菌廣泛分布于土壤中，是數(shù)量最多和種群最豐富的土壤微生物，植物根際細菌在保護植物免受病原微生物的侵染過程中扮演著重要角色[14-15]。例如，抗青枯病番茄的根際土壤中高豐度的黃桿菌科Flavobacteriaceae微生物可以幫助易感病番茄抵御青枯菌Ralstonia solanacearum的侵害[16]；從人參根際土壤中分離的枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis和哈茨木霉菌 Trichoderma harzianum可以抑制人參灰霉病菌Botrytis cinerea Pers.和根腐病菌Fusarium solani菌絲生長[17]。Luo等[18]研究表明，在三七連作過程中被顯著抑制的一些細菌，如假單胞菌屬Pseudomonas、芽孢桿菌屬Bacillus和伯克氏菌屬Burkholderia等對三七根腐病菌表現(xiàn)出很好的拮抗活性，外源添加這些細菌能顯著改善三七的連作障礙。因此，能否通過農(nóng)藝措施改變連作三七的根際細菌群落狀態(tài)從而減輕三七根腐病的發(fā)生值得深入探究。

土壤微生物的結(jié)構(gòu)和功能受到病原菌[19]、溫度[20,21]、水分[22,23]、肥料[24]、pH[25,26]等眾多生物和非生物因素的影響。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，輪作和間作等農(nóng)事操作也會顯著改變土壤的微生物，進而影響作物的健康[27,28]。如在香蕉連作地上輪作木薯可使土壤中真菌和病原菌數(shù)量顯著降低，細菌豐度以及細菌/真菌比值顯著增加，香蕉枯萎病發(fā)病率從90.4%降低到40.2%[29]；玉米與烤煙輪作能夠降低煙草黑脛病、根腐病和根結(jié)線蟲病的發(fā)病率，進一步分析發(fā)現(xiàn)輪作煙田根際土壤中拮抗菌如鞘脂單胞菌屬 Sphingomonas、假單胞菌屬Pseudomonas等的相對豐度顯著提高[30]。輪作也是緩解三七連作障礙的常用措施，相對于連作土壤，輪作土壤微生物的豐富度指數(shù)和物種多樣性指數(shù)增加[31；水旱輪作對土壤菌群結(jié)構(gòu)也有較好的改善作用，對消減三七連作障礙具有一定的潛力[32]。玉米、小麥、花生、白菜、豆類等常用于與三七進行輪作，但目前輪作周期必須在10年以上[33,34]。因此，篩選適宜植物是輪作緩解三七連作障礙的關(guān)鍵。

茴香Foeniculum vulgare Mill.為傘形科茴香屬一年生或多年生芳香草本植物，其果實、根、莖和葉均可藥食兩用[35]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可將茴香與其他植物進行間作或輪作種植用以防控特定病害的發(fā)生[36-38]。有研究報道，茴香與甜瓜輪作能夠顯著提高根際土壤細菌群落物種豐富度和多樣性，降低甜瓜根腐病發(fā)病程度，從而緩解甜瓜連作障礙[39]。因此，本研究首先將茴香與三七進行輪作種植，評價輪作茴香土壤水浸液緩解三七連作障礙的效果；其次，利用高通量測序方法測定三七連作土壤輪作茴香后對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響；最后，通過分離獲得的可培養(yǎng)細菌與病原菌的對峙培養(yǎng)試驗驗證細菌的變化與根腐病發(fā)生的關(guān)系。通過本研究可探明茴香對土壤微生物細菌群落的影響，為生產(chǎn)上利用茴香與三七輪作緩解連作障礙提供科學依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物：茴香，品種為“四季茴香”，市售。

供試培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基（3 g牛肉浸粉、5 g蛋白胨、2.5 g葡萄糖、18 g瓊脂粉，用去離子水定容至1000 mL）用于土壤細菌的分離；PDA培養(yǎng)基（200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、18 g瓊脂粉，用去離子水定容至1000 mL）用于病原真菌培養(yǎng)和拮抗菌的篩選。

供試病原菌：三七根腐病原菌，腐皮鐮刀菌Fusarium solani和Monographella cucumerina，由云南農(nóng)業(yè)大學從罹病三七根上分離鑒定并保存的致病能力較強的菌株。

1.2 茴香輪作處理

以沸石、玉米稈發(fā)酵物、鋸末、蔗渣、生土等為原料，按照一定的比例配置適宜三七生長的土壤，布于生長槽中。2013年12月移栽一年生三七子條，2015年11月全部挖取，連作土從槽中移出后閑置。2017年3月取適量連作土，混勻后置于培養(yǎng)盆（65 cm×40 cm×18 cm）中裝滿約2/3體積。在盆中播種茴香種子，5月收獲后再植一茬茴香并于 11月收獲，以放置在相同環(huán)境中不種植物的三七連作土為對照。2017年11月采挖茴香時，輕輕抖掉茴香根上附著的大塊土壤、砂礫等物質(zhì)，然后以75%酒精浸泡并晾干的牙刷小心刷取貼附于茴香根上的土壤，即茴香根際土；同時收集相同深度的對照三七連作土壤，全部土壤過40目篩后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩１驹囼炘谠颇限r(nóng)業(yè)大學尋甸大河橋三七種植基地進行。

1.3 三七連作土壤輪作茴香后緩解三七連作障礙的效果評價

選取尋甸（103.13° E，25.67° N；海拔1960 m）松樹林中未種植過三七的樹下區(qū)域，除去上層枯枝落葉，用鋤頭刮取較松軟的土層，混勻后過兩次篩（先后為20目、40目）除去土壤中的植物殘體以及石頭等，帶回實驗室。在培養(yǎng)瓶中加入100 g林下土，點播健康一致的三七種子，每瓶10粒。取輪作茴香后的土壤和三七連作土壤各20 g，分別加滅菌水180 mL，在搖床上以120 r/min搖勻24 h，沉淀取上清液制成10-1g/mL的溶液澆灌三七，每瓶加入20 mL，以加滅菌水為對照處理，每個處理各設(shè)置4個重復(fù)，旋上培養(yǎng)瓶蓋后置于光周期12L : 12D的培養(yǎng)室中。三七出苗長至苗高2 cm左右后開蓋，每2 d補充適量滅菌水保持土壤濕潤。2018年4月調(diào)查并統(tǒng)計三七存苗率。存苗率（%）＝存苗株數(shù)/播種數(shù)×100。

1.4 茴香輪作對三七連作土壤細菌群落的影響測定

取1.2中茴香輪作和對照三七連作土壤樣品，提取樣品總DNA后，根據(jù)保守區(qū)V3＋V4設(shè)計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（Sequenced Reads）。根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系，將Hiseq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接（Merge）成原始Tags序列（Raw Tags），同時對序列的質(zhì)量和拼接的效果進行質(zhì)控過濾，去除嵌合體，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective tags）。使用QIIME（version 1.8.0）軟件中的UCLUST對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU，并基于Silva細菌分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋。將OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫進行比對可得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，進而在各水平（phylum，class，order，family，genus，species）統(tǒng)計各樣品群落組成。最后對各樣品的數(shù)據(jù)進行均一化處理后進行后續(xù)的Alpha多樣性分析（ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon 指數(shù)）和Beta多樣性分析（主成分分析，Principal component analysis，PCA）及后續(xù)分析。本部分試驗在百邁客生物科技有限公司完成。

1.5 茴香根際土壤中拮抗細菌的分離鑒定及拮抗能力驗證

采用稀釋平板法對供試土壤中的細菌進行分離。取10 g土樣加入90 mL無菌水，以120 r/min振蕩30 min后靜置20 min，取上清液即為10-1g/mL的土壤菌懸液，然后用無菌水依次稀釋到10-2、10-3、10-4g/mL。取100 μL 10-4g/mL的菌懸液加入到NA培養(yǎng)基表面，然后用涂布棒涂布均勻，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細菌菌落長出后，挑取不同形態(tài)的單菌落進行純培養(yǎng)，得到純菌落后在NA培養(yǎng)基斜面上置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對分離到的細菌進行16S rDNA鑒定。采用細菌DNA基因組試劑盒（昆明碩陽科技有限公司）提取細菌基因組DNA，方法參見該試劑盒說明書。以細菌16S rDNA通用引物27F/1492R進行PCR擴增，通用引物序列：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR 反應(yīng)體系：無核酸酶水 19 μL，2×PCR Taq Master Mix 25 μL，27F（10 μmol/L） 2.0 μL，1492R（10 μmol /L）2.0 μL，DNA模板 2.0 μL，總體積 50 μL。PCR流程為：95 ℃變性4.5 min后，94 ℃變性40 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃反應(yīng)10 min，得到PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京擎科生物科技有限公司（昆明分公司）測序，將拼接序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，選取相似度高的菌株，確定其分類地位。

結(jié)合高通量測定的結(jié)果，采用平板對峙法驗證顯著變化屬的細菌分離物對三七根腐病菌的拮抗活性。將供試三七病原菌用打孔器制成直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，在與其距離2.5 cm的位置對稱接種4株相同的細菌分離物，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每處理設(shè)置4次重復(fù)，以只接病原菌的PDA平板作為對照。待對照菌落長至培養(yǎng)皿的2/3時，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，篩選對三七主要病原菌具有拮抗活性的細菌分離物，并采用“十字交叉法”測量菌落半徑，按下列公式計算抑菌率。抑制率（%）＝（對照菌落半徑—對峙培養(yǎng)菌落半徑）/對照菌落半徑×100。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2010和SPSS 18.0、Origin Pro等軟件進行統(tǒng)計分析并繪圖，采用獨立樣本T檢驗和Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 輪作茴香能緩解三七連作障礙

在澆灌無菌水、三七連作土壤水浸液和茴香輪作土壤水浸液3個處理中，澆灌滅菌水的存苗率（50%）顯著高于另外兩個處理，澆灌茴香輪作土壤水浸液的存苗率次之，連作土壤水浸液最低，不足30%，表明連作土壤水浸液會顯著降低三七的存苗率；澆灌輪作茴香土壤水浸液存苗率顯著高于連作土壤，表明輪作茴香一定程度上能緩解三七的連作障礙，但存苗率仍低于澆灌滅菌水的處理（圖1）。

圖1 三七連作土壤輪作茴香后土壤水浸液對三七存苗率的影響Fig. 1 The effect of fennel rotation soil extract on survival rate of P. notoginseng

2.2 輪作茴香對三七連作土壤細菌群落的影響

2.2.1 輪作茴香對土壤細菌多樣性的影響 在97%的序列相似度水平上，將輪作茴香和三七連作土壤的序列劃分到2010和1987個OTU上，輪作茴香后獲得的OTU數(shù)量顯著高于三七連作土（表2）。輪作茴香后細菌豐富度指數(shù)（ACE index）顯著增加，細菌多樣性指數(shù)（Shannon index）也呈增加趨勢，但未達到顯著水平（表2）。

表2 三七連作土壤輪作茴香后對細菌多樣性的影響Table 2 Bacterial diversity index in the treatment soil samples

在OTU水平上對輪作茴香和三七連作土壤做主成分分析（PCA）以反映兩組樣本間的差異（圖2）。由圖2可知，PC1和PC2是造成兩組樣品的最大差異特征，貢獻率分別為77.61%和18.01%，可以解釋變量的絕大部分信息。輪作茴香和三七連作土壤可以完全分開，表明兩組樣本間差異相對較大，即輪作茴香明顯改變了三七連作土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)。

圖2 OTU水平上茴香輪作和三七連作土壤主成分分析Fig. 2 Principal component analysis of fennel rotation soil and continuous cropping soil of P. notoginseng at OTU level

2.2.2 輪作茴香對土壤細菌門水平群落結(jié)構(gòu)的影響 在門水平上，高通量測序得到的輪作茴香和三七連作土壤中的細菌歸類到23個門（圖3A）。兩組處理中相對豐度大于1%的優(yōu)勢門均有8個，分別為變形菌門 Proteobacteria、放線菌門 Actinobacteria、酸桿菌門 Acidobacteria、綠彎菌門 Chloroflexi、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、擬桿菌門Bacteroidetes、藍藻門Cyanobacteria和疣微菌門Verrucomicrobia（圖3B）。在這些類群中，輪作茴香后變形菌門、放線菌門和疣微菌門相對豐度呈增加趨勢，其余5個門的相對豐度呈下降趨勢（圖3B）。

圖3 三七連作土壤輪作茴香后對細菌門水平的影響Fig. 3 Effect of fennel rotation on bacteria at phylum level in continuous cropping soil of P. notoginseng

2.2.3 輪作茴香對土壤細菌屬水平群落結(jié)構(gòu)的影響 在屬水平上，檢測到的細菌歸類到357個屬。同三七連作土壤相比，輪作茴香使相對豐度顯著增加的屬有66個，歸屬于10個門，其中變形菌門31個，放線菌門 10個，擬桿菌門 8個，酸桿菌門和綠彎菌門各 5個，藍藻門和疣微菌門各 2個，厚壁菌門Firmicutes、迷蹤菌門Elusimicrobia和芽單胞菌門Gemmatimonadetes各1個。在這10個門中，除厚壁菌門和迷蹤菌門外，其余8個均為相對豐度大于1%的優(yōu)勢門（圖4）。輪作茴香使相對豐度顯著減少的屬有30個，歸屬于6個門，其中變形菌門10個，放線菌門8個，酸桿菌門7個，擬桿菌門和綠彎菌門各2個，厚壁菌門1個（圖4）。在這6個門中，除厚壁菌門外，其余5個均為優(yōu)勢門。從圖4中還可以看出，輪作茴香后變形菌門和放線菌門顯著增加的屬多于顯著下降的屬，與2.2.2中這兩個門相對豐度增加的趨勢一致；酸桿菌門顯著增加的屬少于顯著下降的屬，與2.2.2中該門相對豐度減少的趨勢也一致。

圖4 不同門水平上相對豐度顯著增加或減少的細菌屬的數(shù)量Fig. 4 Overall changes of bacteria at genus level

在相對豐度顯著增加和減少的96個屬中，豐度均值＞0.2%的優(yōu)勢屬見表3。輪作茴香后顯著增加的優(yōu)勢屬有13個，相對豐度最高的是放線菌門的Pseudarthrobacter，其相對豐度在三七連作土和茴香輪作土中分別是1.775%和3.519%；其次是綠彎菌門的Roseiflexus，其相對豐度分別是0.737%和0.924%。在顯著增加的優(yōu)勢屬中，還有比較常見的病原菌拮抗屬假單胞菌屬Pseudomonas和芽孢桿菌屬Bacillus，這兩個屬在三七連作土和茴香輪作土中的相對豐度分別是0.166%和0.407%、0.114%和0.328%。輪作茴香后顯著減少的優(yōu)勢屬有8個，其中相對豐度最高的是酸桿菌門的一類不可培養(yǎng)的屬uncultured_c_Subgroup_6，在三七連作土和茴香輪作土中分別是 3.471%和 3.067%；其次為放線菌門的 Nocardioides，其相對豐度分別是3.263%和2.343%；酸桿菌門的Bryobacter相對豐度也比較高，在兩種處理中分別是1.734%和1.306%（表3）。整體來看，三七連作土壤輪作茴香后細菌相對豐度顯著增加的屬多于顯著減少的屬，且豐度增加的屬中還包含抗根腐病的細菌屬，即輪作茴香使土壤朝著利于三七生長的方向發(fā)展。

表3 輪作茴香后相對豐度顯著增加和降低的優(yōu)勢屬Table 3 Genera with significant changes in relative abundance ＞ 0.2% in the continuous cropping soil (CCS) and fennel rotation soil (FRS)

2.3 芽胞桿菌和假單胞菌對三七根腐病菌的拮抗效果

在上述豐度顯著變化的屬中，假單胞菌屬Pseudomonas和芽胞桿菌屬Bacillus被認為是常見的拮抗病原菌生長的有益菌屬[40-43]。為更好地利用茴香根際微生物防控三七根腐病，本研究從茴香輪作土壤中分離到細菌45株，結(jié)合高通量測序的結(jié)果，確定其中有7株假單胞菌和4株芽胞桿菌。將分離得到的假單胞菌和芽孢桿菌與三七根腐病菌腐皮鐮刀菌Fusarium solani和Monographella cucumerina進行對峙培養(yǎng)，篩選出2株假單胞菌和1株芽孢桿菌具有較好的拮抗活性，將其編號為P_1、P_2和B_1。P_1、P_2和B_1對腐皮鐮刀菌Fusarium solani的抑制率均在40%左右（++）；對Monographella cucumerina的拮抗效果更好，抑制率均在65%～75%之間（+++）。

圖5 拮抗細菌鑒定及拮抗活性測定。Fig. 5 Identification of antagonistic bacteria and antagonistic activity tests.

3 討論

三七連作障礙的形成機制較為復(fù)雜，涉及到病原微生物增加、自毒物質(zhì)積累（皂苷和酚酸等）、土壤理化性質(zhì)惡化（養(yǎng)分、pH、電導率等）、生長環(huán)境改變（溫度、光照、濕度）等諸多因素，輪作是克服連作障礙最常用和簡單有效的方法[2]。本研究的試驗結(jié)果顯示，相對于連作土壤，輪作茴香后的土壤水浸液能夠顯著提高三七的存苗率；張子龍[31]的研究也證實，三七連作土輪作玉米、小麥等作物7年后，所栽植三七的存苗率（65.11%）顯著高于連作2年土（9.09%），與新土上的存苗率（77.43%）無顯著差異。由此可見，輪作可提高三七的存苗情況，對于消減三七的連作障礙具有明顯效果。

眾多研究表明，輪作可通過減少病原菌數(shù)量[44,45]、促進下茬植物生長[46]、改善根際微生物狀況[6,47]等來緩解作物連作障礙，而根際微生物與植物健康密切相關(guān)[16,48]。本研究的結(jié)果顯示，輪作茴香的土壤與三七連作土壤的根際細菌群落在 PCA圖上可明顯分開，輪作茴香后根際細菌豐富度顯著提高。因此，茴香輪作土壤水浸液促進三七存苗的機制可能與改善土壤細菌群落狀況有關(guān)。

在屬水平上，輪作茴香后相對豐度顯著增加的屬有66個，其中優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞0.2%）有13個，包含芽胞桿菌屬Bacillus和假單胞菌屬Pseudomonas等常見拮抗菌屬。凡責艷[40]從不同類型土壤中分離對三七根腐病菌有較好拮抗效果的細菌，芽孢桿菌屬Bacillus是最主要的類群；假單胞菌屬Pseudomonas是常見的植物根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhinoacteria，PGPR），對植物生長和拮抗病原菌具有很好的效果[41-43]。本研究也從土壤中分離到1株芽孢桿菌和2株假單胞菌，對峙試驗發(fā)現(xiàn)其對三七根腐病菌生長有較強的抑制效果。根腐病爆發(fā)是三七連作障礙最主要的表現(xiàn)[2]，茴香輪作可能通過抑制根腐病菌的生長減輕根腐病的發(fā)生從而緩解三七的連作障礙。除常見的拮抗菌屬外，優(yōu)勢屬 Pseudarthrobacter和Roseiflexus在輪作茴香后相對豐度也顯著增加，在三七連作土和茴香輪作土中的相對豐度分別為1.775%和3.519%、0.737%和0.924%。已有研究報道，Pseudarthrobacter的細菌具有固氮作用和溶磷作用，能提高植物對氮素的吸收同化能力，增加植物對磷的吸收，提高作物產(chǎn)量[49]；從馬鈴薯根際土壤中分離出的一株P(guān)seudarthrobacter還能夠分泌物植物生長激素吲哚乙酸（Indole acetic acid，IAA）[50]。Roseiflexus為綠色非硫光合細菌，具有較強的代謝能力和物質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，對作物生長發(fā)育有益[51]。因此，茴香輪作后Pseudarthrobacter和Roseiflexus等微生物可能通過幫助三七養(yǎng)分吸收促進三七生長，進而緩解因養(yǎng)分失衡導致的三七連作障礙。在輪作茴香后顯著減少即在三七連作土中相對豐度更高的優(yōu)勢菌屬有一類不可培養(yǎng)的屬uncultured_c_Subgroup_6、Nocardioides和Bryobacter等，在三七連作土和茴香輪作土中的相對豐度分別是3.471%和3.067%、3.263%和2.343%和1.734%和1.306%。有研究報道，Nocardioides是造成健康與易感病（黑脛病、根腐病和青枯?。煵莞H土壤微生物群落組成差異的關(guān)鍵物種之一，在易感病煙草根際土壤中的相對豐度更高，可能與煙草病害的發(fā)生有關(guān)[52]；但也有研究發(fā)現(xiàn)西藏青稞根際的Nocardioides具有一定的溶磷、抗病和產(chǎn)IAA的能力[53]，故Nocardioides對三七生長及抗根腐病的作用需要進一步的研究。uncultured_c_Subgroup_6和Bryobacter與植物生長和病害的關(guān)系報道較少，故也需要進一步的試驗證實其在三七生長中的作用。由于本研究只選用了單一的NA培養(yǎng)基在固定的環(huán)境條件下分離可培養(yǎng)細菌，故分離到并進行功能驗證的細菌種類較少。未來試驗中將參照培養(yǎng)組學[54]的方法，進一步選用 LB（Luria-Bertani）、TSA（Tryptose Soya Agar）、R2A瓊脂（R2A Agar）等多種培養(yǎng)基結(jié)合不同的培養(yǎng)條件分離更多細菌并進行功能驗證。

輪作茴香能夠提高三七的存苗率可能還與茴香根系分泌物對病原菌的化感抑制作用以及對三七生長的促進作用有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，茴香根系分泌物對甜瓜枯萎病菌尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum具有化感抑制作用，而對甜瓜種子萌發(fā)和幼苗生長表現(xiàn)出促進效果[39]；茴香根系能使煙草疫霉菌 Phytophthora parasitica游動孢子裂解，茴香組織揮發(fā)物和浸提液對疫霉菌菌絲生長也有抑制作用[55]。本研究僅從輪作茴香對根際細菌群落的改善角度解析輪作效果并不全面，后續(xù)還需明確茴香輪作后三七根腐病菌數(shù)量變化，解析茴香化感物質(zhì)對三七及根腐病原菌的化感作用現(xiàn)象及機理。

綜上，茴香輪作后的土壤水浸液可以提高三七存苗率，輪作后土壤的細菌群落豐富度增加，有益菌尤其是對根腐病菌具有抑制活性的拮抗菌的豐度增加，有利于減輕三七根腐病發(fā)生，使土壤微生物朝著利于三七生長的方向改變。因此，利用茴香與三七輪作用于緩解連作障礙具有一定的潛力。