林 龍，葛程程，蔣建東，錢國(guó)良*

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

產(chǎn)酶溶桿菌Lysobacter enzymogenes OH11屬黃單胞科Xanthomonadaceae、溶桿菌屬Lysobacter，是一種對(duì)多種植物病原卵菌和真菌有很強(qiáng)拮抗作用的生防細(xì)菌[1]。產(chǎn)酶溶桿菌無(wú)鞭毛，在自然生境中依賴于細(xì)胞表面附著的IV型菌毛（Type IV pilus）進(jìn)行蹭行運(yùn)動(dòng)[2-4]。通過(guò)這種獨(dú)特的運(yùn)動(dòng)方式，菌株OH11可以接近并附著在絲狀病原真菌和卵菌的菌絲上[5,6]，進(jìn)而利用幾丁質(zhì)酶、纖維素酶等多種胞外水解酶和 HSAF（Heat-Stable Antifungal Factor）等次級(jí)代謝產(chǎn)物酶消解菌絲[7-9]，抑制病原菌的生長(zhǎng)。在這個(gè)過(guò)程中，溶桿菌的基因表達(dá)需要受到精確的時(shí)空調(diào)控以完成向病原菌的運(yùn)動(dòng)和攻擊。轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到關(guān)鍵的作用。螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）家族轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)菌中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，其可以通過(guò)HTH功能域結(jié)合DNA，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[10]，其中LysR（transcriptional activator of lysine biosynthesis）和GntR（gluconate operon transcriptional repressor）兩類轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)菌中得到廣泛的研究，在黃單孢菌Xanthomonas中可以調(diào)控細(xì)菌的代謝、運(yùn)動(dòng)性、致病性等多種生理學(xué)功能[11-14]。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶溶桿菌OH11的LysR家族轉(zhuǎn)錄因子LysRLe是4-羥基苯甲酸（4-HBA）的受體，4-HBA可以增強(qiáng)LysRLe與HSAF合成關(guān)鍵基因lafB啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，從而促進(jìn)HSAF的合成[15]。產(chǎn)酶溶桿菌OH11中LysR家族轉(zhuǎn)錄因子是否參與運(yùn)動(dòng)性的調(diào)控還沒(méi)有得到研究。在大豆斑疹病菌Xanthomonas axonopodis pv. glycines中LyR家族轉(zhuǎn)錄因子LcrX可以調(diào)控其游動(dòng)性、生物膜形成、致病性等過(guò)程[12]。推測(cè)產(chǎn)酶溶桿菌中可能存在可以調(diào)控運(yùn)動(dòng)性的LysR轉(zhuǎn)錄因子，因此在OH11的基因組中隨機(jī)選取3個(gè)LysR家族轉(zhuǎn)錄因子Le1404、Le2114和Le3293的編碼基因進(jìn)行研究。

GntR家族轉(zhuǎn)錄因子在產(chǎn)酶溶桿菌中的功能尚未報(bào)道。在野油菜黃單胞菌Xanthomonas campestris pv.campestris中GntR家族轉(zhuǎn)錄因子HpaR1在侵染過(guò)程中正調(diào)控了III型分泌系統(tǒng)致病基因的表達(dá)，是誘導(dǎo)植物過(guò)敏反應(yīng)和致病性所必需的[11]。在柑橘黃單胞菌Xanthomonas citri中GntR家族轉(zhuǎn)錄因子YtrA調(diào)控了III型分泌系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)性、對(duì)寄主的黏附力、胞外酶的產(chǎn)生等過(guò)程，并且是其致病必需的[14]。為了探究產(chǎn)酶溶桿菌中GntR轉(zhuǎn)錄因子是否有類似的功能，從OH11的基因組中隨機(jī)選取2個(gè)GntR家族轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因Le2114和Le1155進(jìn)行研究。

本研究利用同源重組的方法對(duì)3個(gè)LysR家族蛋白（Le1404、Le2114和Le3293）以及2個(gè)GntR蛋白（Le1155和Le1310）的編碼基因進(jìn)行敲除，通過(guò)一系列表型分析，解析這些轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控產(chǎn)酶溶桿菌OH11蹭行運(yùn)動(dòng)和HSAF合成中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

大腸桿菌和產(chǎn)酶溶桿菌OH11均使用LB（Luria Broth）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中大腸桿菌適用于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)。菌株OH11及其衍生菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存，適用于28 ℃、220 r/min培養(yǎng)?？股兀嚎敲顾兀↘m 100 μg/mL或30 μg/mL，適用于OH11）、慶大霉素（Gm 25 μg/mL適用于大腸桿菌；Gm 150 μg/mL，適用于OH11）。100% TSB培養(yǎng)基：稱取Trypic Soy Broth（Sigma）30 g，加入ddH2O攪拌溶解至總?cè)萘繛? L。10% TSB培養(yǎng)基：稱取Trypic Soy Broth 3.0 g，加入ddH2O攪拌溶解至總?cè)萘繛? L。幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：稱取10 g幾丁質(zhì)加入約100 mL HCl后攪拌直至呈黏稠的糊狀物，過(guò)濾后于4 ℃靜置，每隔12 h棄上清，直至pH約為7.0。稱取0.7 g K2HPO4、0.3 g KH2PO4、0.5 g MgSO4、0.01 g Fe2(SO4)3、0.001 g ZnSO4、0.5 g酵母提取物加入400 mL溶解后的幾丁質(zhì)，加入ddH2O定容至1 L。

1.2 引物設(shè)計(jì)

參考OH11全基因組，所有引物用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)（表1），均由金唯智生物技術(shù)有限公司提供。

表1 本試驗(yàn)中所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.3 DNA的提取、連接、轉(zhuǎn)化及感受態(tài)的制備

DNA的提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及感受態(tài)的制備等操作參見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。

1.4 缺失突變體的構(gòu)建

用滅菌牙簽挑取8個(gè)通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化而得到的一次交換子轉(zhuǎn)接到1 mL LB中，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)3 h；取100 μL菌液涂布于含10%蔗糖和100 μg/mL Km抗生素的LB平板上，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)2～3 d，此步驟目的是去除一次交換子，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子染色體上整合進(jìn)pEX18GM載體，該載體上的sacB基因是一個(gè)反向篩選標(biāo)記基因，陽(yáng)性一次轉(zhuǎn)化子在含有蔗糖的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)；一次交換轉(zhuǎn)化子在沒(méi)有抗生素等培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，能夠通過(guò)等位基因同源重組發(fā)生第二次交換，進(jìn)而pEX18GM載體離開(kāi)染色體，即產(chǎn)生目的基因缺失突變體或野生型菌株；將得到的雙交換子分別在LB＋Km＋Gm和LB＋Km平板上劃線，選擇可以在LB＋Km平板上生長(zhǎng)同時(shí)不能在LB＋Km＋Gm平板上生長(zhǎng)的交換子，然后通過(guò)PCR驗(yàn)證缺失突變體的準(zhǔn)確性。

1.5 菌落形態(tài)觀察

挑取單菌落于LB中，28 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。按2%的接種量轉(zhuǎn)接至10% TSB中，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)8 h（OD600nm＝1.0）。取1 mL菌液至離心管中，6000 r/min離心3 min，加入ddH2O懸浮菌體，調(diào)整OD600nm等于1.0。吸取2 μL菌液，分別滴在10% TSB、100% TSB、LB平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察結(jié)果。

1.6 黃色素的提取與檢測(cè)

挑取待測(cè)單菌落于LB中，28 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)；1%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LB中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h；吸取8 mL菌液于50 mL離心管中，12000 r/min離心5 min，棄去上清，將菌體沉淀轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，加入750 μL甲醇，劇烈振蕩直至所有菌體裂解，然后在通風(fēng)廚內(nèi)加入750 μL的氯仿，吹打至充分混勻；12000 r/min離心10 min，取有機(jī)相于新的2 mL離心管中，用酶標(biāo)儀OD445nm測(cè)定。

1.7 蹭行運(yùn)動(dòng)觀察

挑取單菌落于LB中，28 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。按2%的比例轉(zhuǎn)接至10% TSB中，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600nm＝1.0。將濾紙平鋪在培養(yǎng)皿中，均勻加入1 mL的滅菌水浸濕濾紙。吸取1 mL融化好的5% TSB固體培養(yǎng)基平鋪于載玻片上，凝固待用。取1 mL菌液于空的培養(yǎng)皿中，用燒過(guò)的鑷子夾取蓋玻片，用蓋玻片的一邊沾取少許菌液后輕放于5% TSB的載玻片上。每個(gè)處理重復(fù)3次。置于28 ℃培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察。

1.8 HSAF的提取及HPLC檢測(cè)

HSAF的提?。禾羧〈郎y(cè)單菌落接種到LB中，28 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。按照1%比例轉(zhuǎn)接到10% TSB中，28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取3 mL菌液于長(zhǎng)玻璃管中，加入12 μL濃鹽酸和3 mL乙酸乙酯，固定好管口，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)3 h。吸取2 mL上清至2 mL離心管，放置通風(fēng)櫥中吹干。風(fēng)干后加入200 μL甲醇溶解，離心并過(guò)濾。

HPLC檢測(cè)：流動(dòng)相A、B分別為H2O（0.005 mol/L TFA）、CH3CN（0.005 mol/L TFA）。HPLC的檢測(cè)參數(shù)如表2所示，檢測(cè)波長(zhǎng)為318 nm。

表2 HSAF的HPLC檢測(cè)參數(shù)Table 2 Parameter of HPLC for HSAF detection

1.9 幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)

挑取待檢測(cè)單菌落接種到LB中，28 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600nm＝1.0。取2 mL菌液，6000 r/min離心3 min，棄去上清，加入ddH2O懸浮菌體，調(diào)整OD600nm＝1.0。將2 μL待測(cè)菌液點(diǎn)在幾丁質(zhì)酶篩選平板上，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（OH11），每組3個(gè)重復(fù)，置于28 ℃恒溫箱倒置避光培養(yǎng)3～5 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的構(gòu)建和驗(yàn)證

本研究在OH11基因組中選取了3個(gè)LysR家族蛋白（Le1404、Le2114和Le3293）以及2個(gè)GntR蛋白（Le1155和Le1310），利用SMART網(wǎng)站進(jìn)行功能域分析（表3）。利用染色體同源重組的方法獲得LysR家族的3個(gè)突變體ΔLe1404、ΔLe2114、ΔLe3293和GntR家族的2個(gè)突變體ΔLe1155、ΔLe1310（表4）。

表3 LysR蛋白和GntR蛋白功能域分析Table 3 Functional domain analysis of LysR and GntR proteins

表4 突變體PCR驗(yàn)證Table 4 The PCR of mutants

2.2 突變體Le1404、Le2114、Le3293、Le1310、Le1155菌落形態(tài)

對(duì)突變體菌落形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)突變體ΔLe1404、ΔLe2114、ΔLe3293、ΔLe1310、ΔLe1155的菌落形態(tài)均與OH11無(wú)顯著差異。菌落在LB、10% TSB、100% TSB培養(yǎng)基平板上均呈圓形。在LB培養(yǎng)基平板上菌落為黃色，光滑透亮；在10% TSB培養(yǎng)基平板上菌落為白色，濕潤(rùn)透亮，可看見(jiàn)菌落邊緣的圓形暈圈；在100% TSA培養(yǎng)基平板上菌落為白色，較為干燥（圖1）。

圖1 突變體的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony observation of mutants

2.3 突變體Le1404、Le2114、Le3293、Le1310、Le1155黃色素產(chǎn)量

黃色素能夠保護(hù)細(xì)菌免受紫外線和氧化的傷害，在細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中也起著重要作用[17]，對(duì)這5個(gè)突變體的黃色素產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定。按照1.6節(jié)方法提取黃色素，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD445nm，得到結(jié)果如圖2所示，ΔLe1404、ΔLe2114、ΔLe3293、ΔLe1310、ΔLe1155突變體與 OH11相比，黃色素產(chǎn)量接近一致，且無(wú)顯著差異。

圖2 突變體黃色素產(chǎn)量檢測(cè)Fig. 2 Yellow pigment production detection of mutants

2.4 ΔLe2114和ΔLe1155蹭行運(yùn)動(dòng)

產(chǎn)酶溶桿菌在環(huán)境中需要依靠蹭行運(yùn)動(dòng)接近病原菌，從而進(jìn)行進(jìn)一步攻擊[6]。用蓋玻片沾取OD600nm＝1的菌液，輕放在5% TSB固體培養(yǎng)基上，靜置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用顯微鏡觀察蹭行運(yùn)動(dòng)。如圖3所示，OH11野生型菌液向一側(cè)擴(kuò)散，邊緣有大量運(yùn)動(dòng)開(kāi)來(lái)的單個(gè)桿狀菌體，并且有清晰可見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)軌跡；ΔLe1404、ΔLe3293、ΔLe1310突變體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)與OH11相似，并未影響OH11的蹭行運(yùn)動(dòng)；突變體ΔLe2114、ΔLe1155菌液邊緣未見(jiàn)運(yùn)動(dòng)菌體，無(wú)向外擴(kuò)散的痕跡，喪失了蹭行運(yùn)動(dòng)能力。

圖3 ΔLe2114和ΔLe1155菌株蹭行運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)缺陷Fig. 3 ΔLe2114 and ΔLe1155 showed defect in twitching motility

2.5 ΔLe1155的HSAF產(chǎn)量

HSAF具有廣譜的抗真菌活性，是OH11中重要的生防因子[9]，因此對(duì)突變體HSAF的產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè)。首先提取OH11與突變體的HSAF，接著使用高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)HSAF產(chǎn)量，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，得到如圖4所示結(jié)果，ΔLe1404、ΔLe2114、ΔLe3293、ΔLe1310突變體的HSAF產(chǎn)量與OH11相比無(wú)顯著差異，ΔLe1155的HSAF產(chǎn)量有明顯下降趨勢(shì)。

圖4 Le1155突變導(dǎo)致OH11的HSAF產(chǎn)量下降Fig. 4 Mutation of Le1155 led to HSAF biosynthesis reduction in OH11

2.6 突變體Le1404、Le2114、Le3293、Le1310、Le1155幾丁質(zhì)酶活性

OH11可以分泌幾丁質(zhì)酶瓦解病原真菌的細(xì)胞壁[18]，基于其重要的生防功能，對(duì)這五個(gè)突變體的幾丁質(zhì)酶活性進(jìn)行鑒定。經(jīng)過(guò)在幾丁質(zhì)板上的點(diǎn)板試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示OH11與ΔLe1404、ΔLe2114、ΔLe3293、ΔLe1310、ΔLe1155突變體均能在菌落周圍的幾丁質(zhì)板上形成明顯的降解圈，如圖 5所示，表明突變體并未喪失幾丁質(zhì)酶分泌能力。

圖5 突變體幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)Fig. 5 Chitinase activity detection of mutants

3 討論

利用同源重組的方法，我們獲得產(chǎn)酶溶桿菌OH11 Le1404、Le2114、Le3293、Le1310、Le1155共5個(gè)基因的敲除突變體，發(fā)現(xiàn)Le2114和Le1155的突變顯著抑制了OH11的蹭行運(yùn)動(dòng)，說(shuō)明這2個(gè)基因可能參與了蹭行運(yùn)動(dòng)的調(diào)控；同時(shí)ΔLe1155的HSAF產(chǎn)量顯著下降，說(shuō)明Le1155可能參與了HSAF合成的調(diào)控。這5個(gè)基因的突變均不影響菌落形態(tài)、黃色素產(chǎn)生、纖維素酶的合成，說(shuō)明Le2114和Le1155對(duì)相應(yīng)表型的調(diào)控具有特異性。

溶桿菌沒(méi)有鞭毛，依靠IV型菌毛介導(dǎo)的蹭行運(yùn)動(dòng)進(jìn)行移動(dòng)，從而接近并攻擊病原真菌[4]，因此蹭行運(yùn)動(dòng)是產(chǎn)酶溶桿菌的關(guān)鍵生防因子。產(chǎn)酶溶桿菌的IV型菌毛的組裝需要菌毛蛋白、ATP酶、內(nèi)膜蛋白、外膜蛋白、處理菌毛蛋白前體的前導(dǎo)肽酶等一系列蛋白[4]，這些蛋白的表達(dá)受到精密的調(diào)控，如菌毛調(diào)控蛋白PilR可以結(jié)合菌毛蛋白基因pilA的啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控菌毛蛋白的合成[19]。產(chǎn)酶溶桿菌OH11中的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Clp可以直接結(jié)合到pilA基因和pilMONOPQ操縱子的啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控菌毛的合成[20]。我們發(fā)現(xiàn)LysR家族轉(zhuǎn)錄因子Le2114和GntR家族轉(zhuǎn)錄因子Le1155都可以調(diào)控蹭行運(yùn)動(dòng)，這兩個(gè)蛋白是否是可以直接結(jié)合菌毛組裝相關(guān)蛋白啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控菌毛的組裝還有待進(jìn)一步研究。

產(chǎn)酶溶桿菌合成的HSAF是一種重要的生防代謝物，其合成是由一個(gè)包含10個(gè)基因的基因簇完成的，這個(gè)基因簇形成一個(gè)操縱子，由一個(gè)啟動(dòng)子（pHSAF）調(diào)控基因簇的表達(dá)[21]。HSAF的合成受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如Clp、LysRLe、LetR、LarR[15,21-23]等。同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控HSAF的過(guò)程中存在相互作用，如LysRLe是4-HBA的受體并且正調(diào)控larR的轉(zhuǎn)錄，而4-HBA負(fù)調(diào)控larR的轉(zhuǎn)錄，LysRLe和LarR均正調(diào)控HSAF的合成[23]。我們發(fā)現(xiàn)GntR家族轉(zhuǎn)錄因子Le1155同樣可以調(diào)控HSAF的合成，Le1155能否直接結(jié)合pHSAF，Le1155調(diào)控HSAF的過(guò)程是否與其他轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)基因敲除和表型分析首次報(bào)道了產(chǎn)酶溶桿菌OH11中LysR家族轉(zhuǎn)錄因子Le2114可以調(diào)控蹭行運(yùn)動(dòng)，GntR家族轉(zhuǎn)錄因子Le1155可以調(diào)控蹭行運(yùn)動(dòng)和HSAF的合成，這些結(jié)果為進(jìn)一步研究溶桿菌蹭行運(yùn)動(dòng)和HSAF合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的線索，同時(shí)也為從遺傳上獲得高運(yùn)動(dòng)性及HSAF高產(chǎn)菌株，提高產(chǎn)酶溶桿菌生防菌劑的防效提供理論基礎(chǔ)。