陳 峰，王長方，王 俊，陳文樂，胡進(jìn)鋒，吳 瑋，姚錦愛*

（1. 福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福州 350013；2. 三明市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，三明 365000）

茶尺蠖 Ectropis oblique又名茶尺蛾、俗稱拱拱蟲，屬鱗翅目 Lepidoptera尺（蛾）蠖科 Geometridae，在我國浙、蘇、皖等地茶區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，是引起我國茶樹生產(chǎn)問題的重要害蟲之一[1]。茶尺蠖以幼蟲取食茶葉造成主要危害，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可將茶樹葉片及嫩芽全部吃光，對(duì)茶葉的品質(zhì)及產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。對(duì)其防治需要尋找一種較為安全、有效和經(jīng)濟(jì)的防控措施?，F(xiàn)階段國內(nèi)該蟲的防控偏重于使用化學(xué)農(nóng)藥，易造成“3R”和藥害問題[2-4]。生物防治是一種安全、有效、持久的控害方法，且蟲生真菌挖掘利用已成為害蟲生防的重要發(fā)展方向之一[5-7]。目前，雖然已有球孢白僵菌Beauveria bassiana的一些菌株用于防控楊尺蠖Apocheima cinerarius等害蟲[8]，但由于不同地理和寄主來源的菌株具有一定的寄主?；?，對(duì)目標(biāo)害蟲的致病力也存在差異，因此有必要再探尋一些相對(duì)廣譜的蟲生真菌菌株用于防控茶尺蠖。為此，本研究嘗試從茶園腐殖層昆蟲尸體上分離蟲生真菌，通過形態(tài)學(xué)特征觀察和rDNA-ITS序列分析方法確定其分類地位，測定菌株對(duì)茶尺蠖的胞外酶活性和毒力，探討它的生防潛力和應(yīng)用前景，為利用蟲生真菌防控茶樹害蟲提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株分離自福建省茶園腐殖層昆蟲尸體；供試茶尺蠖幼蟲采集于福建省茶園，在溫度25～26 ℃、相對(duì)濕度55%～60%、光周期14L:10D條件下飼養(yǎng)至次代，取食量最大、為害最重的4齡幼蟲備用；供試試劑均為分析純。DNA提取試劑盒、2×Taq Master Mix購自上海生物工程股份有限公司；所用引物ITS1/ITS4由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 菌株鑒定

1.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察 參照形態(tài)描述進(jìn)行菌株的初步鑒定[9,10]。將供試菌株接種于 PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d 后在顯微鏡下觀察菌株菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)大小等分類特征并照相。

1.2.2 菌株分子鑒定 用DNA提取試劑盒提取DNA后，采用 ITS 序列進(jìn)行菌株的分子生物學(xué)鑒定。所用引物為 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）；PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5 μL，DNA 模板 2 μL，引物各 1.0 μL，ddH2O 8.5 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，54 ℃退火 50 s，50 ℃～55 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確定后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。將測序結(jié)果與 GenBank 基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，為明確菌株與同屬其他種的親緣關(guān)系，選擇已公布的具有代表性的菌株序列，構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 供試菌株對(duì)茶尺蠖幼蟲的致病力測定

將保存的供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基平板上，置于溫度28 ℃的HGZ-150型光照培養(yǎng)箱內(nèi)活化培養(yǎng)8 d；然后加入5 mL含0.05%吐溫-80的無菌水脫溶孢子，經(jīng)3層脫脂紗布過濾得孢子原液；用紐鮑爾血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在NIKON E200型生物顯微鏡下統(tǒng)計(jì)孢子原液的孢子數(shù)并計(jì)算孢子濃度，制成1.00×108cfu/mL的孢子原液備用。

取制備的孢子原液，以10的梯度稀釋4次，分別獲得濃度為1.00×104、1.00×105、1.00×106、1.00×107、1.00×108cfu/mL的5個(gè)溶液，以0.05%吐溫-80無菌水作空白對(duì)照，共6個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次；取直徑為12 cm的塑料盤，在底部鋪上直徑為10 cm的吸水棉，再蓋上一層相同直徑的濾紙片，加入10 mL無菌水，放3片的茶嫩葉，用軟毛筆向每個(gè)處理挑取供試茶尺蠖4齡幼蟲15只，浸泡10 s后挑到濾紙上，晾干2 min后再挑到葉片上，保鮮膜封口；扎孔通氣，后置于與1.1相同條件的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，每24 h觀察、記錄死蟲數(shù)（死亡蟲體長出菌絲計(jì)為有效感染，每次記錄后挑除死亡蟲體），并及時(shí)更換茶嫩葉，10 d后統(tǒng)計(jì)試蟲的累計(jì)校正死亡率，并計(jì)算供試菌株對(duì)茶尺蠖幼蟲的LC50和LT50。

1.4 供試菌株胞外酶活性測定

將茶尺蠖4齡幼蟲置于-80 ℃冰箱中速凍2 h，再置于80 ℃的DHG-9030型電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，將烘干的蟲體研磨成細(xì)粉末；參考董晶[11]的方法稱?。↘2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g和FeSO4·7H2O 0.01 g溶于1000 mL蒸餾水中，制成察氏液體培養(yǎng)基）；稱取茶尺蠖蟲尸粉0.2 g作為唯一的碳、氮源，加入含有250 mL察氏液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于121 ℃的LDZX-50FFBS型不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器中滅菌20 min，冷卻后制成含酶活誘導(dǎo)基質(zhì)的察氏液體培養(yǎng)基備用。

參考董晶[11]的方法，將上述制備的含酶活誘導(dǎo)基質(zhì)的察氏液體培養(yǎng)基接種10 mL制備的孢子懸浮液（1×108cfu/mL），置于ZWY-240型旋轉(zhuǎn)式搖床上，于溫度 25 ℃、125 r/min條件下，連續(xù)培養(yǎng)10 d，每天取3份2 mL的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液在冷凍離心機(jī)4 ℃下12000 g 離心20 min。取上清液即為粗酶液，將粗酶液保存在-80 ℃超低溫冰箱中備用。蛋白酶活性測定：取待測粗酶液1.0 mL加入1.0 mL酪蛋白溶液（以酪蛋白為底物，加入0.05 mol/L、pH 8.5的Tris HCl緩沖液配成的1% W/V 酪蛋白溶液）；參考黃鵬等[12]的方法，檢測供試粗酶液活性，以每分鐘催化分解酪蛋白生成 1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)酶活單位。幾丁質(zhì)酶活性測定：取待測粗酶液0.5 mL加入0.5 mL膠狀幾丁質(zhì)，參考黃鵬等[12]的方法，檢測供試粗酶液活性，以每分鐘催化分解幾丁質(zhì)生成1 μg N-乙酰酰氨基葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活單位。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Mega 5.2軟件對(duì)供試菌株進(jìn)行多序列比對(duì)，以NJ法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行聚類分析。在DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件上，利用機(jī)率值分析法計(jì)算供菌株對(duì)茶尺蠖幼蟲的LC50和LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察及分子鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 供試菌株經(jīng)侵染試驗(yàn)驗(yàn)證、對(duì)茶尺蠖4齡幼蟲具有毒力（圖1A）。菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d時(shí)，菌落為淡黃色、圓形放射狀生長、邊緣為短絨狀白色菌絲（圖1B）；培養(yǎng)10 d時(shí)，菌落外半部產(chǎn)生墨綠色分生孢子層，呈環(huán)形堆積狀向四周擴(kuò)散，并形成皺褶（圖 1C）。顯微鏡下進(jìn)行觀察，菌絲透明、寬1.6～2.1 μm，具分支和分隔（圖1D）。分生孢子梗為圓柱狀瓶梗，寬1.9～2.7 μm單生或聚集（圖1E），從小?；啃纬赡钪闋罨蜷L鏈狀排列的分生孢子（圖1D）；分生孢子單細(xì)胞，淡綠色，長橢圓形至短棒狀，大小為（6.2～8.9）μm×（2.1～3.1）μm（圖1 F）。

圖1 菌株CHMA?005孢子和菌絲不同時(shí)期的形態(tài)觀察Fig. 1 Morphological observation for spores and hyphae of strain CHMA?005 at different stages

2.1.2 分子鑒定 通過引物ITS1/ITS4對(duì)菌株DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR后獲得長度為527 bp的rDNA- ITS基因序列，經(jīng)BLAST比對(duì)，與 M. anisopliae 菌株（登錄號(hào)：MN727141；EF051728）相似度均達(dá)到99%以上。使用MEGA 5.2構(gòu)建NJ（Neighbor-joiningmethod）系統(tǒng)發(fā)育樹，可觀察到菌株CHMA-005與MN727141和 EF051728聚為一支（圖 2），因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及分子學(xué)分析，將本次分離的菌株鑒定為金龜子綠僵菌。并將本株金龜子綠僵菌登陸至GenBank，登錄號(hào)為MN883882。

圖2 基于rDNA?ITS序列的菌株CHMA?005及其相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 The phylogenetic tree of the strain CHMA?005 and others related species based on rDNA?ITS sequences by ML method

2.2 供試菌株對(duì)茶尺蠖的致病力

供試菌株 5個(gè)處理濃度對(duì)茶尺蠖的毒力各不相同。隨著濃度的提高，致死能力越強(qiáng)，其中 1.00×108濃度處理的茶尺蠖幼蟲的死亡率在第8 d時(shí)達(dá)到100%；1.00×107和1.00×106cfu/mL濃度處理的茶尺蠖幼蟲的死亡率在第10 d時(shí)達(dá)到100%；而1.00×105和1.00×104cfu/mL濃度處理的茶尺蠖幼蟲的死亡率在第10 d時(shí)僅為83.33 %和75%（圖3）。

圖3 金龜子綠僵菌菌株CHMA?005對(duì)茶尺蠖幼蟲的致病力Fig. 3 Pathogenicity of M. anisopliae CHMA?005 aganist E. oblique

供試菌株在不同侵染時(shí)間下對(duì)茶尺蠖幼蟲的 LC50各不相同；LC50隨侵染時(shí)間的減少，呈現(xiàn)梯度上升趨勢，侵染的時(shí)間越短，LC50越大，在第4 d時(shí)LC50最大，為2.27×109cfu/mL；侵染的時(shí)間越短，LC50越小，第8 d時(shí)LC50最小，為1.84×104cfu/mL（表1）。

表1 金龜子綠僵菌菌株CHMA?005對(duì)茶尺蠖幼蟲的LC50Table 1 LC50 of M. anisopliae CHMA?005 against E. oblique

供試菌株在不同濃度下對(duì)茶尺蠖幼蟲的LT50各不相同；其中1.00×108、1.00×107和1.00×106cfu/mL濃度處理的LT50時(shí)間較短，分別為3.57、4.52和5.03 d；1.00×105cfu/mL濃度處理的LT50時(shí)間較長，為6.98 d；1.00×104cfu/mL濃度處理的LT50時(shí)間最長，為7.77 d，是1.00×108cfu/mL濃度處理的2.17倍（表2）。

表2 金龜子綠僵菌菌株CHMA?005對(duì)茶尺蠖幼蟲的LT50Table 2 LT50 of M. anisopliae CHMA?005 against of E. oblique

2.3 供試菌株的胞外酶活性

供試菌株在不同誘導(dǎo)時(shí)間下的 2種胞外酶活性各不相同。金龜子綠僵菌的蛋白酶活性在第 1 d時(shí)為15.90 U/mL，并在之后呈現(xiàn)上升趨勢；第6 d時(shí)達(dá)到最大值，為27.73 U/mL；在之后的第7～10 d，蛋白酶活性呈現(xiàn)下降趨勢。最終在第10 d降為20.47 U/mL。幾丁質(zhì)酶活性，在第1 d時(shí)為19.10 U/mL，并在之后呈現(xiàn)上升趨勢；第6 d時(shí)達(dá)到最大值，為31.43 U/mL；在之后的第7 d至第10 d，蛋白酶活性呈現(xiàn)下降趨勢。最終在第10 d降為25.20 U/mL（圖4）。

圖4 金龜子綠僵菌菌株的胞外酶活性Fig. 4 Extracellular enzyme activity of M. anisopliae

3 討論

利用蟲生真菌對(duì)害蟲進(jìn)行生物防控，因其與環(huán)境友好、對(duì)人畜相對(duì)安全、易于規(guī)模生產(chǎn)、又不產(chǎn)生害蟲抗性等問題，日益受到人們的重視和青睞。目前，雖然已有球孢白僵菌的一些菌株用于防控楊尺蠖等害蟲[8]，但由于不同地理和寄主來源的菌株具有一定的寄主?；?，對(duì)目標(biāo)害蟲的致病力也存在差異，因此有必要再探尋一些相對(duì)廣譜的蟲生真菌菌株用于防控茶尺蠖。本研究從茶園腐殖層蟲尸上分離獲得一株可侵染茶尺蠖的蟲生真菌CHMA-005，通過菌落外觀特征、菌絲和分生孢子顯微觀察初步確定為綠僵菌，鑒定后又對(duì)該菌株ITS 序列進(jìn)行測定（GenBank登錄號(hào)為MH898794），同時(shí)對(duì)GenBank近源序列進(jìn)行比對(duì)和聚類分析，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)菌株為金龜子綠僵菌。

生物防治潛力評(píng)估是評(píng)價(jià)和利用蟲生真菌進(jìn)行害蟲防治的基礎(chǔ)，評(píng)價(jià)指標(biāo)主要涉及菌株致病力等[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌CHMA-005菌株侵染茶尺蠖4齡幼蟲10 d后，致死率、LC50和LT50分別可達(dá)100%、1.84×104cfu/mL和3.57 d，高于姚紅青等[8]利用球孢白僵菌Beauveria bassiana TST05侵染楊尺蠖的效果；該菌株蛋白酶活性和幾丁質(zhì)酶活性均在第6 d達(dá)到最大值，分別為31.43和27.73 U/mL，略高于李保國[15]測定的金龜子綠僵菌M7-5-7胞外蛋白酶活性和幾丁質(zhì)酶活性?？梢?，金龜子綠僵菌CHMA-005對(duì)茶尺蠖的致病力和胞外酶活性高，具有良好的生防潛力和應(yīng)用前景。

本研究雖初步明確了金龜子綠僵菌 CHMA-005對(duì)茶尺蠖的致病力和胞外酶活性，但對(duì)該菌的田間防效及茶尺蠖幼蟲在侵染過程中的蟲體組織器官病理變化情況、保護(hù)酶和解毒酶活性的變化等防御反應(yīng)情況尚不明確，因此今后可繼續(xù)開展此方面的相關(guān)研究，以期為利用蟲生真菌防控茶尺蠖等茶園害蟲提供更多的支持。