笪 虎，張建中，宋建寬，徐長明，熊 卓

(1.漣水縣人民醫(yī)院骨科，江蘇 漣水 223400；2.淮安市急救中心，江蘇 淮安 223001；3.清華大學(xué)機(jī)械工程系，北京 100084)

針對(duì)大段骨缺損，臨床上常使用組織工程骨進(jìn)行修復(fù)。其中，同種異體骨是重要的組織工程骨之一[1-2]。但是，同種異體骨細(xì)胞親和力(骨傳導(dǎo)能力)不強(qiáng)，宿主細(xì)胞難以在其微孔表面大量黏附與增殖，臨床治療效果不佳[3-4]。為增強(qiáng)同種異體骨的細(xì)胞親和力，本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中，采用凍干法，使用多聚賴氨酸溶液對(duì)兔同種異體骨的微孔進(jìn)行表面改性，其細(xì)胞親和力得到了顯著提升；此外，該方法成本低廉，步驟簡單，易于掌握和操作[5-7]。然而，有研究報(bào)道，多聚賴氨酸具有細(xì)胞毒性，可抑制細(xì)胞的生長[8]。為了使同種異體骨表面改性后具有最佳的細(xì)胞親和力與最低的細(xì)胞毒性，本研究通過探討多聚賴氨酸溶液的最佳濃度，旨在為其今后的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

成年新西蘭大白兔由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，兔同種異體骨購自西京醫(yī)院骨庫，左旋多聚賴氨酸(分子量15萬～30萬)、L-抗壞血酸、地塞米松、胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉、噻唑藍(lán)(MTT)、DMSO購自美國Sigma，D-Hank’s液、轉(zhuǎn)化生長因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibico，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 兔同種異體骨的表面改性和分組 兔同種異體骨均取自于兔椎體松質(zhì)骨，切割成邊長為3 mm的正方體，然后分別浸入100 mg/mL、30 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL、0.025 mg/mL和0.01 mg/mL的多聚賴氨酸溶液中，持續(xù)振蕩2 h，微孔被溶液充分浸透后取出，置于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔放置1粒。先在-20 ℃下預(yù)冷2 h，隨即轉(zhuǎn)至-80 ℃下冷凍1 h，最后置于冷凍干燥機(jī)中干燥24 h。根據(jù)同種異體骨所浸入的多聚賴氨酸濃度，將其分為100 mg/mL組、30 mg/mL組、1 mg/mL組、0.1 mg/mL組、0.025 mg/mL組和0.01 mg/mL組，未經(jīng)表面改性的同種異體骨納入空白對(duì)照組。各組同種異體骨均經(jīng)20 kGy60Co輻照滅菌，于4 ℃密封無菌保存。

1.2.2 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的分離與擴(kuò)增 以戊巴比妥麻醉新西蘭大白兔后，將其股骨大粗隆及周圍皮膚仔細(xì)反復(fù)消毒。持骨穿針，在股骨大粗隆處抽吸約0.5 mL骨髓，迅速滴入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每2 d半量換液1次。采用全骨髓貼壁法提純BMSCs。待細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，進(jìn)行消化、傳代。

1.2.3 BMSCs的種植、誘導(dǎo)和培養(yǎng) 第3代BMSCs置于成骨培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、50 mg/L L-抗壞血酸、1×10-8mol/L地塞米松和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的高糖DMEM)內(nèi)，制成細(xì)胞密度為1×107/mL的懸液。將含2×104個(gè)BMSCs的懸液滴入各組同種異體骨內(nèi)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后添加成骨培養(yǎng)基，每2 d半量換液1次。

1.2.4 MTT比色試驗(yàn)檢測BMSCs黏附、增殖的情況 在培養(yǎng)和誘導(dǎo)的第3、5、7、9、11、13、15、17天，每組分別隨機(jī)抽取8個(gè)標(biāo)本。D-Hank’s液漂洗去除未黏附的細(xì)胞后，采用MTT比色試驗(yàn)法，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其吸光度A值，利用表格記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組的吸光度A值，以間接檢測細(xì)胞在同種異體骨微孔表面黏附、增殖的情況。

1.2.5 檢測各組同種異體骨內(nèi)黏附細(xì)胞表達(dá)ALP的活性 在培養(yǎng)和誘導(dǎo)的第3、5、7、9、11、13、15、17天，每組分別隨機(jī)抽取8個(gè)標(biāo)本。D-Hank’s液漂洗去除未黏附的細(xì)胞后，逐次使用ALP活性測定試劑盒測定ALP的活性。使用酶標(biāo)儀在520 nm波長處測定吸光度A值，利用表格記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組的光吸收值，以間接檢測向成骨細(xì)胞方向分化的細(xì)胞活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BMSCs在同種異體骨內(nèi)的增殖情況

MTT比色試驗(yàn)結(jié)果顯示：BMSCs在各組同種異體骨微孔表面的生長曲線呈拋物線樣，從第3天至第17天，細(xì)胞數(shù)量一直持續(xù)上升，到第11天左右進(jìn)入平臺(tái)期，增速開始減慢。100 mg/mL組、30 mg/mL組、1 mg/mL組、0.1 mg/mL組和0.025 mg/mL組的細(xì)胞數(shù)量較多，增殖速度快，但各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而0.01 mg/mL組和空白對(duì)照組的BMSCs增殖相對(duì)較慢，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)量均少于其余各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 BMSCs在同種異體骨微孔表面的增殖情況

2.2 細(xì)胞表達(dá)ALP的活性比較

BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)、培養(yǎng)后，從第3天至第17天，各組表達(dá)ALP的活性持續(xù)增加，至第11天左右進(jìn)入平臺(tái)期，活性增速減慢，呈拋物線樣。100 mg/mL組、30 mg/mL組、1 mg/mL組、0.1 mg/mL組和0.025 mg/mL組表達(dá)ALP的活性較高，但各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而0.01 mg/mL組和空白對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)ALP的活性較低，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的值均小于其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 BMSCs表達(dá)ALP的活性比較

3 討論

在組織工程研究中，為提高組織工程骨對(duì)細(xì)胞的親和力，優(yōu)化骨傳導(dǎo)能力，常常對(duì)其微孔表面進(jìn)行改性[9-10]。然而，臨床上所使用的同種異體骨在很多病例中難以修復(fù)骨缺損區(qū)，并且長期不被吸收[11-12]。其中，同種異體骨對(duì)細(xì)胞的親和力不足是重要因素[13]，這與其未經(jīng)過表面改性，骨傳導(dǎo)能力未得到優(yōu)化有關(guān)[14-15]。

載玻片表面覆蓋多聚賴氨酸后，其細(xì)胞黏附力明顯增強(qiáng)，組織切片不易脫落[16-17]。受此啟發(fā)，本課題組在前期研究中使用多聚賴氨酸對(duì)同種異體骨進(jìn)行表面改性，發(fā)現(xiàn)表面改性后的同種異體骨對(duì)細(xì)胞的親和力顯著增加，即骨傳導(dǎo)性得到明顯提高[5-7]。此外，也有學(xué)者使用多聚賴氨酸對(duì)其他人工骨進(jìn)行表面改性，并取得了良好的結(jié)果[18-19]。有研究報(bào)道多聚賴氨酸具有細(xì)胞毒性，可抑制細(xì)胞生長的特性，本課題組通過探索多聚賴氨酸溶液用于同種異體骨表面改性的最佳濃度，以期既能將細(xì)胞毒性控制在最低，又能發(fā)揮其最佳作用。

本課題組在著手研究之前，查閱了相關(guān)文獻(xiàn)，并參照玻片包被方法所使用的多聚賴氨酸溶液的濃度[17,20-21]，最終選擇濃度為100 mg/mL、30 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL、0.025 mg/mL和0.01 mg/mL的多聚賴氨酸溶液分別對(duì)兔同種異體骨進(jìn)行表面改性。MTT比色試驗(yàn)和細(xì)胞表達(dá)ALP活性的結(jié)果顯示，經(jīng)100 mg/mL、30 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL和0.025 mg/mL多聚賴氨酸溶液表面改性后的同種異體骨微孔表面的細(xì)胞親和力均得到顯著增強(qiáng)，細(xì)胞易在其表面黏附與增殖，均顯著優(yōu)于0.01 mg/mL組和空白對(duì)照組。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，100 mg/mL組、30 mg/mL組、1 mg/mL組、0.1 mg/mL組和 0.025 mg/mL組細(xì)胞增殖的數(shù)量及表達(dá)ALP的活性無明顯差異，提示以上濃度的多賴氨酸溶液對(duì)細(xì)胞的增殖和活力影響相似。100 mg/mL、30 mg/mL的多聚賴氨酸溶液濃度較高，但高濃度的多聚賴氨酸未影響細(xì)胞黏附、增殖和分泌等活力，由此推斷，多聚賴氨酸的細(xì)胞毒性很小，細(xì)胞相容性良好。因此，從經(jīng)濟(jì)、有效方面考慮，本研究推薦對(duì)同種異體骨進(jìn)行表面改性的多聚賴氨酸溶液最佳濃度為0.025 mg/mL。

本研究使用的多聚賴氨酸溶液濃度差異很大，呈指數(shù)級(jí)，然而，并未發(fā)現(xiàn)多聚賴氨酸具有細(xì)胞毒性、抑制細(xì)胞生長等現(xiàn)象。分析可能有以下原因：①多聚賴氨酸的細(xì)胞毒性并沒有其他報(bào)道所稱的那么大，其細(xì)胞相容性良好；②本研究的實(shí)驗(yàn)方法盡可能與臨床運(yùn)用相一致，而與所報(bào)道的方法不一致，故得出的結(jié)論亦不同[22-24]。

綜上所述，多聚賴氨酸的細(xì)胞毒性較低，利用其對(duì)同種異體骨進(jìn)行表面改性的最佳濃度為0.025 mg/mL，本研究結(jié)果為提高同種異體骨在臨床應(yīng)用中的效果提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究是體外實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周圍的環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境不同，故得出的結(jié)果尚不能完全代表體內(nèi)的實(shí)際情況。擬在今后的研究中采取動(dòng)物體內(nèi)植入的方法，進(jìn)行更加深入地觀察與分析。