潘綺雪，陳奎奎#，馬兆臣，李月婷，劉璐璐，屈碧瓊，劉明妍，劉 潔，賈志鑫，肖紅斌*

基于體內(nèi)暴露量的丹荷顆粒質(zhì)量標(biāo)志物研究

潘綺雪1, 2，陳奎奎1, 2#，馬兆臣1, 2，李月婷1, 2，劉璐璐1, 2，屈碧瓊1, 2，劉明妍1, 2，劉 潔2, 3，賈志鑫2, 3，肖紅斌2, 3*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥分析與轉(zhuǎn)化研究中心，北京 100029 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029

基于丹荷顆粒中15個特征性成分（丹酚酸B、虎杖苷、大黃素、大黃素-8--β--葡萄糖苷、白藜蘆醇、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、橙皮苷、川陳皮素、荷葉堿、-去甲基荷葉堿、-去甲基荷葉堿、去氫荷葉堿、烏藥堿）在大鼠血漿暴露量的測定，篩選丹荷顆粒中適于作為質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）的成分。以EC-C18柱為預(yù)柱、ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱為色譜柱，以0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動相，采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測掃描質(zhì)譜，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法；大鼠ig丹荷顆粒，采集不同時間點的血漿樣品，并測定血漿樣品中各特征性成分的質(zhì)量濃度，計算其血漿暴露量；確定體內(nèi)高暴露的成分，對其進(jìn)一步進(jìn)行活性及制劑含量分析，依據(jù)體內(nèi)暴露量、高暴露成分活性、制劑相應(yīng)成分含量確定Q-Marker。丹酚酸B、虎杖苷、大黃素、大黃素-8--β--葡萄糖苷、白藜蘆醇、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、橙皮苷、川陳皮素、荷葉堿、-去甲基荷葉堿、-去甲基荷葉堿、去氫荷葉堿、烏藥堿在大鼠血漿中暴露量分別為（1340.45±167.64）、（232.49±37.05）、（677.51±71.61）、（33.99±20.74）、（281.53±32.32）、（25.01±4.90）、（16.85±2.88）、（11.89±2.69）、（113.71±23.05）、（11.13±1.94）、（168.69±42.68）、（2595.00±314.78）、（9.55±1.36）、（1.29±0.11）、（13.96±0.88）ng?h/mL，其中丹酚酸B、虎杖苷、大黃素、金絲桃苷、紫云英苷、橙皮苷、荷葉堿具有調(diào)血脂活性且在制劑中質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于0.1 mg/g。丹酚酸B、虎杖苷、大黃素、槲皮素、橙皮苷、柚皮苷和荷葉堿可作為丹荷顆粒的Q-Marker。

丹荷顆粒；暴露量；質(zhì)量標(biāo)志物；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；定量分析；丹酚酸B；虎杖苷；大黃素；槲皮素；橙皮苷；柚皮苷；荷葉堿

丹荷顆粒來源于名老中醫(yī)郭維琴經(jīng)驗方丹荷湯，由君藥丹參及薏苡仁、臣藥虎杖及山楂、佐藥陳皮和使藥荷葉6味中藥配伍組成，具有活血消食、祛濕健脾的功效，臨床用于治療濕邪困脾型高脂血癥。課題組前期確定了丹荷顆粒的制備工藝，并證實丹荷顆粒能夠顯著改善高脂血癥金黃地鼠的各項指標(biāo)[1]。在丹荷顆粒質(zhì)量控制方面，目前主要集中于對其指標(biāo)性成分的含量測定上，尚缺乏有效可行的質(zhì)量控制方法。

劉昌孝院士[2]于2016年提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）概念，密切中藥有效性-物質(zhì)基礎(chǔ)-質(zhì)量控制標(biāo)志性成分的關(guān)聯(lián)度，為中藥質(zhì)量控制提供了新的思路和方法?！坝行浴笔荙-Marker“五原則”中的核心要素[3]，也是Q-Marker研究較傳統(tǒng)質(zhì)量控制的主要提升。中藥復(fù)方給藥途徑多為口服給藥，有效成分被吸收入血后的原型成分及其代謝產(chǎn)物才是具有療效的“效應(yīng)成分”。He等[4]提出，首先選擇吸收入血的體內(nèi)成分，確定藥物在體內(nèi)的暴露程度，然后將藥物中與體內(nèi)物質(zhì)密切相關(guān)的成分（前藥）或者與藥效具有一致性的成分作為初步確定的Q-Marker，之后應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、在線生物活性指紋圖譜和高通量篩選等藥理學(xué)研究對初步確定的Q-Marker的生物活性進(jìn)行評價，從而確定最終的Q-Marker。馬建超等[5]利用藥動學(xué)對瓜蔞中香葉木素-7--葡萄糖苷、香葉木素、芹菜素、香草酸和肉桂酸進(jìn)行祛痰止咳Q-Marker的篩選，并采用多元統(tǒng)計方法系統(tǒng)聚類分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）對篩選出的候選Q-Marker進(jìn)行評價。

課題組前期基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選丹荷顆粒的活性成分并經(jīng)體外實驗驗證，對丹荷顆粒的Q-Marker進(jìn)行了探索，初步確定虎杖苷、柚皮苷可作為丹荷顆粒的Q-Marker[8]。本研究在體內(nèi)成分定性分析的基礎(chǔ)上[6]，測定丹酚酸B、虎杖苷、大黃素、大黃素-8--β--葡萄糖苷、白藜蘆醇、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、橙皮苷、川陳皮素、荷葉堿、-去甲基荷葉堿、-去甲基荷葉堿、去氫荷葉堿、烏藥堿15個特征性成分在大鼠體內(nèi)的暴露量，將體內(nèi)暴露量顯著且具有增強(qiáng)藥效作用的成分作為初步確定的Q-Marker的基本要素，并結(jié)合前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，以實際檢測到吸收入血的藥源性成分為化學(xué)成分源，篩選出與丹荷顆粒調(diào)血脂機(jī)制密切相關(guān)的活性成分[1]，更加深入完整地確定丹荷顆粒的Q-Marker，使其作為反映丹荷顆粒有效性的標(biāo)示性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠12只，10周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0038。動物飼養(yǎng)于溫度23 ℃、濕度50%～70%、換氣速度約15次/h、人工光照12 h/d的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。動物實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號1117052400125）。

1.2 藥品與試劑

對照品虎杖苷（批號H-012-181216）、金絲桃苷（批號J-012-170317）、異槲皮苷（批號Y-076- 171216）、紫云英苷（批號Z-020-171205）、橙皮苷（批號110721-201818）、丹酚酸B（批號D-012- 170417）、白藜蘆醇（批號B-018-160928）、大黃素- 8--β--葡萄糖苷（批號D-018-160928）、大黃素（批號Must-16031601）、烏藥堿（批號W-011-161212）、-去甲基荷葉堿（批號D-008-180917）、-去甲基荷葉堿（批號DFZY-191227）、荷葉堿（批號111566-201706）、川陳皮素（批號C-015-170316）、去氫荷葉堿（批號FZY-M1805230304）購自成都瑞芬思有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；利血平對照品（批號X04A9Y56856，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自上海源葉生物科技有限公司；淫羊藿苷對照品（批號110737-201516，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為質(zhì)譜級，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；甲酸為質(zhì)譜級，購自美國Sigma公司；去離子水由Milli-Q純水系統(tǒng)自制；其他試劑均為分析純；丹荷顆粒由中日友好醫(yī)院醫(yī)院制劑室提供。

1.3 儀器

1260 HPLC-QQQ 6470高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；KQ-500 E型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；Sigma3-18KS高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；Practum SQP電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；QQMD200-2干式氮吹儀（上海啟前電子科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

EC-C18預(yù)柱（5 mm×3 mm，2.5 μm）、ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（50 mm×3 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）。正離子電離模式（ESI+），梯度洗脫：0～3 min，15%～65% B；3～5 min，65%～100% B；5～7 min，100% B；體積流量為0.5 mL/min；柱溫為45 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。負(fù)離子電離模式（ESI－），梯度洗脫：0～0.5 min，5%～15% B；0.5～7.0 min，15% B；7.0～9.0 min，15%～85% B；9.0～9.5 min，85%～100% B；9.5～12.0 min，100% B；體積流量為0.5 mL/min；柱溫為45 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

正/負(fù)離子電離模式；干燥氣溫度為300 ℃；干燥氣體積流量為7 L/min；噴霧氣壓力為35 psi（1 psi＝6.895kPa）；鞘氣溫度為300 ℃，鞘氣體積流量為11 L/min；毛細(xì)管電壓為4000 V（ESI+）/3500 V（ESI－）；監(jiān)測模式為動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式（dynamic multiple reaction monitor，dMRM）。待測成分、內(nèi)標(biāo)化合物的離子對選擇及相關(guān)參數(shù)見表1。

2.3 對照品及內(nèi)標(biāo)溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取各對照品，置于10 mL量瓶，加入二甲基亞砜助溶，以甲醇定容，超聲溶解，得到各對照品儲備溶液。精密吸取各對照品儲備液，以80%甲醇配制成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.3.2 質(zhì)控對照品溶液的制備 精密吸取各對照品儲備溶液，以80%甲醇稀釋得到各質(zhì)控對照品溶液溶液，其中虎杖苷質(zhì)量濃度分別為0.8、50.0、350.0 ng/mL，金絲桃苷質(zhì)量濃度分別為0.8、20.0、80.0 ng/mL，異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為0.8、20.0、80.0 ng/mL，紫云英苷質(zhì)量濃度分別為0.8、10.0、40.0 ng/mL，橙皮苷質(zhì)量濃度分別為0.8、50.0、350.0 ng/mL，丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為7.5、100.0、400.0 ng/mL，白藜蘆醇質(zhì)量濃度分別為10.0、50.0、160.0 ng/mL，大黃素-8--β--葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別為0.8、50.0、350.0 ng/mL，大黃素質(zhì)量濃度分別為5.0、50.0、350.0 ng/mL，烏藥堿質(zhì)量濃度分別為0.8、30.0、160.0 ng/mL，-去甲基荷葉堿質(zhì)量濃度分別為0.3、30.0、160.0 ng/mL，-去甲基荷葉堿質(zhì)量濃度分別為6.3、60.0、800.0 ng/mL，荷葉堿質(zhì)量濃度分別為0.8、60.0、400.0 ng/mL，川陳皮素質(zhì)量濃度分別為0.8、30.0、160.0 ng/mL，去氫荷葉堿質(zhì)量濃度分別為0.1、3.0、80.0 ng/mL。

表1 待測成分、內(nèi)標(biāo)化合物的離子對及相關(guān)參數(shù)

2.3.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 分別精密吸取淫羊藿苷、利血平對照品儲備溶液，以80%甲醇稀釋得到質(zhì)量濃度分別為40、5 ng/mL的淫羊藿苷（IS1）和利血平（IS2）內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 丹荷顆粒溶液的制備

精密稱取丹荷顆粒20 g置50 mL離心管中，加入生理鹽水40 mL，超聲混勻，得到質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的丹荷顆粒溶液。

2.5 分組與給藥

SD大鼠隨機(jī)分為對照組和丹荷顆粒（3.33 g/kg，相當(dāng)于臨床劑量的3倍）組，每組6只。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水，丹荷顆粒組ig 2 mL丹荷顆粒溶液，對照組ig等體積生理鹽水。分別于給藥后0.08、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00、12.00、24.00 h，大鼠眼底靜脈叢采血，每次取血量約300 μL，血液置抗凝管中，4 ℃、4000 r/min離心10 min，取上清液，得血漿樣品，于?80 ℃保存。

2.6 血漿樣品的處理

2.6.1 基質(zhì)工作溶液的制備 精密吸取100 μL對照組血漿，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，加入10 μL混合對照品溶液，加入400 μL冷乙腈，渦旋3 min，4 ℃、4000 r/min離心10 min，取上清液，氮氣吹干。殘渣用100 μL 80%甲醇復(fù)溶，超聲助溶，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.6.2 基質(zhì)質(zhì)控樣品的制備 精密吸取100 μL對照組血漿，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，加入10 μL質(zhì)控對照品溶液，加入400 μL冷乙腈，渦旋3 min，4 ℃、4000 r/min離心10 min，取上清液，氮氣吹干。殘渣用100 μL 80%甲醇復(fù)溶，超聲助溶，4 ℃、4000 r/min離心10 min，取上清液得到基質(zhì)質(zhì)控樣品。

2.6.3 待測樣品的制備 精密吸取丹荷顆粒組血漿100 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，加入410 μL冷乙腈，渦旋3 min，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液，氮氣吹干。殘渣用100 μL 80%甲醇復(fù)溶，超聲助溶，4 ℃、4000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 專屬性考察 分別對6組對照組血漿樣品和丹荷顆粒組血漿樣品，按“2.6”項下方法處理，按“2.1”“2.2”項下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測。結(jié)果如圖1、2所示，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)未對待測成分及內(nèi)標(biāo)化合物產(chǎn)生干擾，該方法專屬性良好，可用于血漿中待測成分的含量測定。

2.7.2 線性關(guān)系及檢測限的考察 對照組血漿樣品按“2.6”項下方法處理，平行制備3份基質(zhì)工作溶液和基質(zhì)質(zhì)控樣品，按“2.1”“2.2”項下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測。以各待測成分與內(nèi)標(biāo)化合物色譜峰峰面積之比為縱坐標(biāo)（），各待測成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行擬合分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；以信噪比≥3時對應(yīng)的待測成分質(zhì)量濃度定義為檢測限，將線性范圍的最低點定義為定量下限，得到15種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、、線性范圍及檢測限見表2，結(jié)果表明各待測成分在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于待測樣品的定量分析。

圖1 負(fù)離子模式下對照組血漿樣品(A)、基質(zhì)工作溶液(B) 和丹荷顆粒組血漿樣品(C) 的dMRM色譜圖

圖2 正離子模式下對照組血漿樣品(A)、基質(zhì)工作溶液(B) 和丹荷顆粒組血漿樣品(C) 的dMRM色譜圖

2.7.3 精密度及準(zhǔn)確度考察 在基質(zhì)工作溶液中選擇高、中、低3個質(zhì)量濃度作為質(zhì)量控制樣品，并進(jìn)行日內(nèi)、日間精密度考察，結(jié)果顯示精密度RSD≤15%、準(zhǔn)確度為85.07%～114.62%，符合要求，表明儀器狀態(tài)較穩(wěn)定，滿足各待測成分的測定要求。

2.7.4 穩(wěn)定性考察 在基質(zhì)工作溶液中選擇高、中、低3個質(zhì)量濃度作為質(zhì)量控制樣品，從短期穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性室溫24 h、?80 ℃反復(fù)凍融3次2個方面進(jìn)行考察。每個質(zhì)量濃度的基質(zhì)質(zhì)控樣品按“2.1”“2.2”項下色譜及質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示穩(wěn)定性RSD≤15%、準(zhǔn)確度為85.2%～113.8%，表明樣品在所考察的儲存條件下穩(wěn)定性良好，符合生物樣品檢測的需求。

2.7.5 基質(zhì)效應(yīng)及回收率考察 A組樣品為精密吸取100 μL去離子水，按“2.6”項下基質(zhì)質(zhì)控樣品配制方法配制而成；B組樣品為精密吸取100 μL對照組血漿，加入420 μL冷乙腈，按“2.6”項下方法配制而成；C組樣品為精密吸取100 μL對照組血漿，按“2.6”項下方法配制而成。每組樣品分為低、中、高3個質(zhì)量濃度，每個樣品測定6次，計算基質(zhì)效應(yīng)及絕對回收率，結(jié)果顯示RSD≤16.7%、準(zhǔn)確度為83.6%～113.9%，表明該方法無基質(zhì)干擾，且樣品前處理方法可行，回收率較高。

表2 15個特征性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢測限

2.8 血藥濃度-時間曲線和血漿暴露量測定

采用經(jīng)方法學(xué)驗證的定量分析方法測定丹荷顆粒組血漿樣品中待測成分的質(zhì)量濃度，采用GraphPad Prism 5軟件繪制血藥濃度-時間曲線見圖3，15個特征性成分的血漿暴露量見表3，-去甲基荷葉堿、丹酚酸B、大黃素、白藜蘆醇、虎杖苷、荷葉堿和橙皮苷血漿暴露量（AUC0→）均大于100 ng?h/mL，表明其在體內(nèi)暴露量較高，可能促進(jìn)丹荷顆粒發(fā)揮調(diào)血脂作用。

3 討論

3.1 測定成分的選擇

在多種中藥中廣泛分布的成分難以反映中藥材的特有性，因此“特有性”也成為中藥Q-Marker確定的重要原則。本研究基于丹荷顆粒6味藥材的成分生源途徑分析與藥理活性對測定成分進(jìn)行篩選。

圖3 15個特征性成分的血藥濃度-時間曲線

表3 15個特征性成分的體內(nèi)暴露量

3.1.1 丹參 丹參為唇形科植物丹參Bge.的干燥根和根莖，以丹參酮類為主的二萜類成分和以丹酚酸為主的酚酸類成分為丹參的特征成分，丹荷顆粒的制備工藝為水提醇沉，水溶性成分溶解性較好，因此重點對丹酚酸類成分進(jìn)行闡述。酚酸的生物合成途徑包括苯丙酸途徑和酪氨酸衍生途徑，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羥基化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為4-香豆酰輔酶A；酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和4-羥基苯基丙酮酸還原酶將酪氨酸代謝為4-羥基苯基乳酸，最終形成丹參素；4-香豆酰輔酶A和丹參素通過酯化酶迷迭香酸合成酶進(jìn)一步偶聯(lián)形成4-香豆酰-3,4-二羥基苯基乳酸，并進(jìn)一步被細(xì)胞色素酶CYP98A14氧化，引入3-羥基形成迷迭香酸；迷迭香酸通過氧化轉(zhuǎn)化為苯氧基，2個苯氧基自發(fā)結(jié)合最終形成丹酚酸B[7]。《中國藥典》2020年版中，丹酚酸B僅用于控制丹參的質(zhì)量；通過丹酚酸B生源合成途徑可知，丹酚酸B直接來源于迷迭香酸，為丹參特有性成分，且是主要的丹酚酸類成分，因此丹酚酸B可作為丹參水溶性丹酚酸類的特征性成分。丹參臨床上可用于治療高脂血癥、動脈粥樣硬化等疾病。丹參多酚酸鹽廣泛用于冠心病的治療[8]，王斌[9]發(fā)現(xiàn)丹酚酸B可有效清除高脂飲食誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生的過量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），提高機(jī)體抗氧化能力，改善免疫功能。綜上，丹酚酸B既為丹參特征性成分，在《中國藥典》2020年版中用于丹參的質(zhì)控，且具有調(diào)血脂作用，為丹參中值得研究的成分。

3.1.2 虎杖 虎杖為蓼科植物虎杖Sieb. et Zucc.的干燥根及根莖，主要包括蒽醌類及茋類成分。茋類成分如白藜蘆醇為植物次生代謝物，其在植物體內(nèi)的生物合成途徑通過苯丙氨酸-丙二酸途徑完成。苯丙氨酸解氨酶合成肉桂酸，肉桂酸在肉桂酸4-羥基化酶催化下轉(zhuǎn)化為對香豆酸，繼而在4-香豆酸-輔酶A連接酶催化下轉(zhuǎn)化為4-香豆酸-輔酶A；二苯乙烯合酶或查爾酮合酶分別將1個4-香豆酸-輔酶A和3個丙二酰輔酶A單位轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇或柚皮素查爾酮；白藜蘆醇被白藜蘆醇-甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為紫檀芪或經(jīng)糖基化轉(zhuǎn)化為虎杖苷[10-11]。白藜蘆醇等茋類成分為蓼科植物特征成分，白藜蘆醇主要提取自虎杖的根、根莖，《中國藥典》2020年版中虎杖苷僅用于控制虎杖的質(zhì)量，因此白藜蘆醇、虎杖苷是虎杖的特征性成分?；⒄溶漳苊黠@降低高脂飲食誘導(dǎo)的家兔血清中三酰甘油（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平[12]；白藜蘆醇可顯著降低高脂血癥大鼠血漿LDL-C水平和肝臟中3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）活性，并提高載脂蛋白（apolipoprotein A-I，Apo A-I）與Apo B比例以及高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平[13]，為虎杖中值得研究的成分。

蒽醌類成分可分為大黃素型和茜草型2類，其中大黃素型蒽醌如大黃素、大黃素甲醚、大黃酚等主要分布于蓼科、豆科等植物中，其羥基分布在母核苯環(huán)兩側(cè)，通過聚酮途徑合成[14]，乙酰輔酶與丙二酸單酰輔酶在植物查耳酮合成酶系催化下進(jìn)行縮合[15]。蓼科植物富含蒽醌類成分，大黃素、大黃素- 8--β--葡萄糖苷能夠顯著降低膳食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平[16-17]，為虎杖中值得研究的成分。

3.1.3 山楂 山楂為薔薇科植物山里紅Bge. var.N.E.Br.或山楂Bge.的干燥成熟果實，主要富含黃酮類成分。黃酮類成分的生物合成途徑是復(fù)合型的，由莽草酸途徑提供3個丙二酰輔酶A環(huán)化形成黃酮A環(huán)，1個4-香豆酰輔酶A形成B環(huán)，3個丙二酰輔酶A和1個香豆酰輔酶A在查耳酮合酶的作用下生成查耳酮；查耳酮在異構(gòu)酶的作用下形成二氫查耳酮，然后在聚合酶、羥化酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等修飾酶催化下，形成其他黃酮類成分[18]。黃酮類成分是山楂的主要生物活性物質(zhì)，金絲桃苷可顯著降低膽固醇并增強(qiáng)血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，可能是山楂治療高脂血癥潛在生物活性成分[19]；異槲皮苷能夠抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)過載和肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平，抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)SOD活性以及TG、丙二醛水平[20]；紫云英苷具有明顯的心臟保護(hù)作用[21]，為山楂中值得研究的成分。

3.1.4 陳皮 陳皮為蕓香科植物橘Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，主要含黃酮類、檸檬苦素類、生物堿類及揮發(fā)油類等成分。柑橘類黃酮的合成主要經(jīng)過苯丙烷代謝途徑，由苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羥基化酶、4-酰基輔酶A連接酶催化合成。首先，苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸合成肉桂酸，肉桂酸經(jīng)肉桂酸4-羥基化酶轉(zhuǎn)化為對香豆酸，三磷酸腺苷、輔酶A和4-?；o酶A連接酶將對香豆酸轉(zhuǎn)化為對香豆酰輔酶A；乙酰輔酶A在乙酰輔酶A復(fù)合物作用下生成丙二酰輔酶A，3分子丙二酰輔酶A和1分子對香豆酰輔酶A在查耳酮合酶作用下縮合生成柚皮素查耳酮，進(jìn)一步通過查耳酮異構(gòu)酶催化，閉環(huán)形成柚皮素。柚皮素是生物合成途徑的中心中間體，經(jīng)甲基化、?；?、糖基化等修飾進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為黃烷酮、黃酮醇和花青素等柑橘類黃酮成分[22-24]。多甲氧基黃酮是柑橘屬植物典型成分，川陳皮素可作為柑橘屬植物特征性成分，且陳皮、青皮的化學(xué)成分主要以橙皮苷為主，《中國藥典》2020年版中陳皮、青皮均將橙皮苷作為質(zhì)控指標(biāo)，因此，橙皮苷、川陳皮素可作為陳皮的特征性成分。橙皮苷和川陳皮素能夠調(diào)節(jié)血脂水平、改善血糖濃度、抑制肥胖[25-26]，并用于預(yù)防餐后高血糖[27]。橙皮苷還可調(diào)節(jié)視黃醇結(jié)合蛋白（retinal binding protein，RBP）、皮膚脂肪酸結(jié)合蛋白（cutaneous fatty-acid binding protein，C-FABP）和心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（heart-type fatty-acid binding protein，H-FABP）mRNA表達(dá)，抑制膽固醇的合成和吸收，改善高膽固醇血癥和脂肪肝[28]。綜上，橙皮苷、川陳皮素為山楂中值得研究的成分。

3.1.5 荷葉 荷葉為睡蓮科植物蓮Gaertn.的干燥葉，主要富含阿樸菲型芐基異喹啉生物堿。阿樸菲類生物堿的共同生源前體為苯丙氨酸或酪氨酸，屬于芐基異喹啉生物堿。酪氨酸經(jīng)脫羧、羥基化形成多巴胺，也經(jīng)轉(zhuǎn)氨基、脫羧基生成4-羥基苯乙醛，再在去甲基烏藥堿合酶催化下，多巴胺和4-羥基苯乙醛縮合形成芐基異喹啉生物堿的第1個前體-去甲烏藥堿；-去甲烏藥堿經(jīng)氧甲基化生成-烏藥堿，再經(jīng)氮甲基化、羥基化、氧甲基化生成-番荔枝堿，分子內(nèi)C-C苯酚耦合轉(zhuǎn)化成紫堇塊堿，進(jìn)一步合成阿樸菲生物堿[29]；-番荔枝堿也可在小檗堿橋酶的作用下進(jìn)入小檗堿合成途徑[30]。阿樸菲類生物堿在番荔枝科、防己科、罌粟科、毛茛科、樟科、木蘭科和小檗科植物中廣泛分布，荷葉堿、-去甲荷葉堿作為荷葉中含量最豐富的生物堿成分，在睡蓮科蓮屬植物中的含量遠(yuǎn)高于其他科屬，且《中國藥典》2020年版中荷葉堿僅用于對荷葉的質(zhì)量控制，特征性明顯。荷葉的主要活性成分如荷葉堿、-去甲基荷葉堿、-去甲基荷葉堿、去氫荷葉堿、烏藥堿等具有調(diào)血脂作用[31]，均為荷葉中值得研究的成分。

綜上所述，本研究基于制劑原藥材的生源合成途徑的特有性分析與藥效兩方面篩選得到丹荷顆粒中15種特征性成分，分別為丹酚酸B、虎杖苷、大黃素、大黃素-8--β--葡萄糖苷、白藜蘆醇、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、橙皮苷、川陳皮素、荷葉堿、-去甲基荷葉堿、-去甲基荷葉堿、去氫荷葉堿、烏藥堿，測定其在大鼠體內(nèi)的暴露量。

3.2 高暴露成分活性及制劑中相關(guān)成分含量分析

“有效性”是Q-Marker的核心要素，也是質(zhì)量控制的最終目的。本研究在前期基礎(chǔ)上分析了15種特征性成分在大鼠血漿中的暴露量，發(fā)現(xiàn)化學(xué)成分群丹酚酸B、虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、橙皮苷、荷葉堿和-去甲基荷葉堿具有較高的體內(nèi)暴露量，有利于丹荷顆粒發(fā)揮調(diào)血脂作用，可以作為初步確定的Q-Marker。

課題組前期采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以實際檢測到吸收入血的藥源性成分為化學(xué)成分源，發(fā)現(xiàn)槲皮素、大黃素、丹酚酸B、丹參酮IIA、柚皮素和川陳皮素可作用于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterol regulatory element binding proteins，SREBP-1c）、SREBP-2、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）等靶點發(fā)揮調(diào)血脂作用[1]。

“可測性”是建立質(zhì)量評價方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的必要條件，需要成分不僅在體內(nèi)有較高的暴露量，且在制劑中具有一定的含量[3]。課題組前期對丹荷顆粒中的25個特征成分進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)其中16個成分滿足成分“可測性”的要求[32]，分別為丹酚酸B、丹參素、迷迭香酸、虎杖苷、大黃素、大黃素-8--β--葡萄糖苷、蘆丁、柚皮苷、金絲桃苷、紫云英苷、沒食子酸、槲皮素、綠原酸、橙皮苷、荷葉堿、烏藥堿，其在制劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于0.1 mg/g。將特征性成分在制劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與體內(nèi)暴露量和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果結(jié)合，篩選出制劑中質(zhì)量分?jǐn)?shù)和體內(nèi)暴露量較高的7個活性成分，分別為丹酚酸B、虎杖苷、大黃素、槲皮素、橙皮苷、柚皮苷、荷葉堿，其在制劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.27、3.23、0.38、0.29、7.47、2.56、0.60 mg/g，均符合Q-Marker“可測性”的要求。

綜上，本研究依據(jù)體內(nèi)暴露量、高暴露成分活性、制劑中相應(yīng)成分含量的結(jié)果，通過特征性成分多環(huán)節(jié)的傳遞和變化，篩選制劑中含量較高、體內(nèi)暴露量較好的特征性成分，并驗證這些成分是與藥效相關(guān)的活性物質(zhì)，最終得出丹酚酸B、虎杖苷、大黃素、槲皮素、橙皮苷、柚皮苷、荷葉堿可作為丹荷顆粒調(diào)血脂的Q-Marker。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on Q-Marker of Danhe Granules based on exposure

PAN Qi-xue1, 2, CHEN Kui-kui1, 2, MA Zhao-chen1, 2, LI Yue-ting1, 2, LIU Lu-lu1, 2, QU Bi-qiong1, 2, LIU Ming-yan1, 2, LIU Jie2, 3, JIA Zhi-xin2, 3, XIAO Hong-bin2, 3

1. School of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. Research Center for Chinese Medicine Analysis and Transformation, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. Beijing Research Institute of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To screen Danhe Granules for quality marker (Q-Marker) based on determination of plasma exposure of 15 characteristic components (salvianolic acid B, polydatin, emodin, emodin-8--β--glucoside, resveratrol, hyperin, isoquercitrin, astragalin, hesperidin, nobiletin, nuciferine,-nornuciferine,-nornuciferine, dehydronuciferin, and coclaurine) in Danhe Granules in rats.EC-C18column was used as pre-column, ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18column was used as column, 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile was used as mobile phase, dynamic multiple response monitoring scanning mode was used for mass spectrometry and HPLC-MS/MS method was established. Rats were ig given Danhe Granules, plasma of rats at different time points were collected, concentration of each component in plasma samples of rats were determined, plasma exposurewere calculated. Components with high exposurewere determined, of which activity and preparation content were further analyzed. Q-Marker were determined according to amount of exposureactivity of high exposure ingredients, corresponding composition and content of the preparation.Plasma exposure levels of salvianolic acid B, polydatin, emodin, emodin-8--β--glucoside, hyperin, astragalin, astragalin, hesperidin, nobiletin, nuciferine,-nornuciferine,-nornuciferine, dehydronuciferin, coclaurine were (1340.45 ± 167.64), (232.49 ± 37.05), (677.51 ± 71.61), (33.99 ± 20.74), (281.53 ± 32.32), (25.01 ± 4.90), (16.85 ± 2.88), (11.89 ± 2.69), (113.71 ± 23.05), (11.13 ± 1.94), (168.69 ± 42.68), (2595.00 ± 314.78), (9.55 ± 1.36), (1.29 ± 0.11), and (13.96 ± 0.88) ng?h/mL, salvianolic acid B, polydatin, emodin, hyperin, astragalin, hesperidin, and nuciferine showed lipid-lowering activity and their contents in preparations were all greater than 0.1 mg/g.Salvianolic acid B, polydatin, emodin, quercetin, hesperidin, naringin, and nuciferine can be used as Q-Marker of Danhe Granules.

Danhe Granules; exposure; quality marker; HPLC-MS/MS; quantitative analysis; salvianolic acid B; polydatin; emodin; quercetin; hesperidin; naringin; nuciferine

R285.5；R285.61

A

0253 - 2670(2021)09 - 2608 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.012

2021-04-10

國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項資助項目（2019ZX09201004-001-022）

潘綺雪（1997—），女，碩士研究生，研究方向為中藥質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: 13865950563 E-mail: paanhzz@163.com

肖紅斌，男，教授。Tel: (010)64286490 E-mail: hbxiao69@163.com

#共同第一作者：陳奎奎（1990—），男，博士，研究方向為中藥物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究。Tel: 13121933979 E-mail: 1358632635@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]