王嫦嫦，鄭思潔，戰(zhàn)藝芳，夏定，白向茹，王利華，姚琪，李婷婷

(武漢市農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與安全研究所，湖北 武漢， 430207)

重金屬是指比重大于5的金屬，包括鉛、鎘、汞、砷、鉻、鋅和銅等45種。其中，對人體危害較大的有鉛、鎘、汞、砷等。重金屬是一種對生物和環(huán)境具有嚴重影響的普遍污染物，其在水體中不能被分解，在微生物的作用下能夠轉(zhuǎn)化為毒性更強的金屬化合物[1]。在食物鏈系統(tǒng)的放大作用下，重金屬容易在動物和人體內(nèi)積累，對黏液組織、腸道、骨骼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等造成嚴重的傷害。此外，長期接觸有毒重金屬可能對動物和人體有致癌作用[2]。

現(xiàn)階段，用于重金屬檢測的方法主要是以原子熒光法[3]、原子吸收法[4]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[5]和電感耦合等離子體質(zhì)譜[6]等為代表的大型儀器分析法，這類方法可對重金屬進行精準定量，但前處理步驟繁瑣、成本較高且要求專業(yè)人員操作。以免疫測定法為代表的快速檢測法由于具有可定性或半定量的檢測重金屬污染物、靈敏度高等特點，被越來越多的用于重金屬的檢測中，然而，特異性抗體的質(zhì)量和較為苛刻的儲存條件等一直是制約其應用的關(guān)鍵問題。近年來，“第四代抗體”——適配體作為抗體識別的替代物，已成為重金屬檢測領(lǐng)域的研究熱點。

適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)技術(shù)體外人工篩選得到的單鏈DNA或RNA，長度一般為25～60個堿基(腺嘌呤A；胸腺嘧啶T；鳥嘌呤G；胞嘧啶C)。與抗體相比，適配體具有高親和力和特異性，更易化學合成與修飾，無免疫原性等優(yōu)點[7-8]。作為一種分子識別元件，適配體可以在芳香環(huán)的疊加、氫鍵、范德華力和靜電作用下，折疊成特定的二級或三級結(jié)構(gòu)后可結(jié)合包括重金屬[9]、蛋白質(zhì)[10]和真菌毒素[11]在內(nèi)的多種靶分子。量子點(quantum dot，QDs)、金納米粒子(Au nanoparticles，AuNPs)、還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide，rGO)等納米材料是用于固定化適配體的有效材料，具有獨特的光學、電子和催化性質(zhì)，應用于適配體技術(shù)可以極大地提高復雜樣品基質(zhì)中重金屬污染物監(jiān)測的靈敏度、選擇性和準確性[12-13]，因此被深入研究并廣泛應用于重金屬的定量檢測。本文概括了重金屬離子Pb2+、Hg2+、Cd2+、Ag+、As3+的適配體序列，并總結(jié)了多種結(jié)合納米材料的適配體傳感器在重金屬檢測中的技術(shù)應用及優(yōu)缺點。

1 適配體檢測方法

近年來，研究者們利用SELEX程序篩選到多種重金屬離子的適配體，表1列舉了利用適配體技術(shù)檢測重金屬Pb2+、Hg2+、Cd2+、Ag+、As3+的方法。

1.1 適配體用于Pb2+的檢測

研究表明[14-17]，3種類型的功能性DNA分子對Pb2+具有特異性的親和力，一種是依賴于Pb2+的8-17 脫氧核酶，其是以Pb2+為輔因子，在易裂核糖核苷位置顯示出裂解活性；第二種是GR-5脫氧核酶，其與依賴于Pb2+的8-17脫氧核酶具有類似的裂解活性，但對Pb2+的選擇性比8-17脫氧核酶要高。近年來，由于具有獨特的高階結(jié)構(gòu)和超高的G-四聚體(G-4)穩(wěn)定化效率，富含G的適配體結(jié)合熒光測定法、比色法和電化學法在重金屬離子Pb2+的檢測中展現(xiàn)出良好的應用前景。LI等[18]利用在Pb2+存在時，富含G的適配體容易從無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)換成更穩(wěn)定的G-4分體結(jié)構(gòu)，開發(fā)了用于水中Pb2+測定的一種高選擇性和高靈敏的適配體電化學法，該方法的線性范圍為0.001～1 000 μmol/L，檢出限為0.4 nmol/L。LONG等[19]基于Pb2+可以誘導適配體構(gòu)象變化，形成穩(wěn)定的G-4/Pb2+復合物，開發(fā)了一種競爭性的適配體熒光測定法，用于環(huán)境樣品中Pb2+的檢測，該方法的線性范圍為1～300 nmol/L，檢出限為0.22 nmol/L。

1.2 適配體用于Hg2+和Ag+的檢測

由于具有可逆的金屬結(jié)合力，目標金屬離子會在離子半徑、配位行為和水合效應等陽離子性質(zhì)的作用下，結(jié)合適配體并誘導產(chǎn)生特異性的二級結(jié)構(gòu)[20-22]。當溶液中含有Hg2+和Ag+時，目標金屬離子會將T-T和C-C錯配轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的堿基對并形成相應的特定結(jié)構(gòu)，其中，T-T錯配會選擇性的捕獲Hg2+以形成T-Hg2+-T復合物[23-24]，而C-C錯配只能識別Ag+形成C-Ag+-C復合物[25-26]。WU等[27]開發(fā)了基于T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的磁性適配體電化學法，用于水樣中Hg2+的測定。由于鏈霉親和素和生物素之間的特異性相互作用，生物素標記的富含T的適配體與固定在磁性玻碳電極表面的鏈霉親和素修飾的磁珠結(jié)合。當溶液中加入Hg2+時，富含T的適配體可以捕獲Hg2+形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，導致電化學信號發(fā)生變化，實現(xiàn)Hg2+的高靈敏和高選擇性測定，該方法的檢出限為0.33 nmol/L，線性范圍為1～200 nmol/L。XI等[28]開發(fā)了基于C-Ag+-C結(jié)構(gòu)的比色法，用于快速、選擇性和靈敏地檢測水溶液中的Ag+，該比色法的線性范圍為1 nmol/L～1 μmol/L，檢出限低至0.236 nmol/L。

1.3 適配體用于Cd2+的檢測

WU等[29]利用SELEX技術(shù)篩選到了Cd2+的高親和力適配體Cd-4(解離常數(shù)為34.5 nmol/L)，對Cd-4堿基序列進行分析，與富含A和C的非重復性單鏈DNA序列相比，富含T和G的單鏈DNA更容易與Cd2+結(jié)合，這與A和C缺乏形成配位鍵的位點，對Cd2+的親和力較弱有關(guān)。在此基礎上，并進一步將Cd-4作為分子識別元件，開發(fā)了用于Cd2+測定的比色法，該比色法的線性范圍為10 nmol/L～1 mmol/L，檢出限低至4.6 nmol/L。

1.4 適配體用于As3+的檢測

KIM等[30]基于親和柱的SELEX技術(shù)篩選到了As3+的高親和力適配體Ars-3(對As3+和As5+的解離常數(shù)分別為7.05 nmol/L和4.95 nmol/L)。WU等[31]利用適配體Ars-3作為分子識別元件，開發(fā)了基于帶正電荷的陽離子聚合物介導的AuNPs聚合的比色法，檢出限為5.3×10-9。然而，由于AuNPs對反應條件十分敏感，該比色法的穩(wěn)定性有待進一步提高。在此基礎上，WU等[32]進一步提出了一種新型的血紅素-H2O2體系氧化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)比色法。在沒有As3+時，適配體Ars-3在π-π作用下結(jié)合到血紅素的吡咯環(huán)上，從而抑制血紅素對TMB的催化活性，溶液呈現(xiàn)藍色。添加As3+后，適配體Ars-3會與As3+結(jié)合形成Ars-3/As3+復合物，游離的血紅素催化氧化TMB，生成二氨基甲酸酯的黃色產(chǎn)物，溶液由藍色逐漸變?yōu)辄S色。該比色法在檢測穩(wěn)定性提高的前提下，實現(xiàn)了As3+的高靈敏和選擇性測定。

現(xiàn)階段，雖然已經(jīng)篩選到了多種重金屬離子的適配體，但利用適配體技術(shù)檢測重金屬只局限在Pb2+、Hg2+、Cd2+、Ag+、As3+等靶標物上，其他重金屬的適配體在應用范圍、特異性和親和力方面的研究仍較為欠缺。

表1 適配體重金屬檢測方法Table 1 Aptamers detection methods for heavy metals

2 基于納米材料的適配體傳感器在重金屬檢測中的應用

基于納米材料的適配體傳感器是以適配體為分子識別元件，以與靶標物的特異性作用引起的直接或間接信號變化并結(jié)合納米材料的獨特性能來進行檢測的一類傳感器[33-35]。根據(jù)信號轉(zhuǎn)換方式的不同，其可分為基于納米材料的電化學適配體傳感器、基于納米材料的熒光適配體傳感器、基于納米材料的比色適配體傳感器、基于納米材料的表面增強拉曼光譜(surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)適配體傳感器等幾大類。表2列舉了幾種基于納米材料的適配體傳感器的優(yōu)缺點及應用現(xiàn)狀。

表2 基于納米材料的重金屬適配體傳感器Table 2 Aptasensors for heavy metal detection based on nanomaterial materials

2.1 基于納米材料的電化學適配體傳感器

將納米材料應用于電化學適配體傳感器中可以有效地提高傳感器的導電性能和催化性能[36-37]，具有設備簡單、靈敏度高、易微型化等特點，是目前重金屬分析最活躍的研究領(lǐng)域之一。

ZHANG等[38]開發(fā)了高靈敏和選擇性檢測Hg2+的電化學適配體傳感器，在Au-S共價鍵作用下固定在金電極表面的DNA-1與適配體雜交形成雙鏈體結(jié)構(gòu)，當體系中存在靶標物Hg2+時，Hg2+特異性的結(jié)合適配體形成更穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，使得與DNA-1雜交的適配體量減少，電化學信號增大。該傳感器的線性范圍寬(0.1～200 nmol/L)，靈敏度高(檢出限為0.05 nmol/L)，并已成功的用于自來水和河水中Hg2+的檢測(加標回收率為96.9%～102%，相對標準偏差為2.35%～3.17%)。ENSAFI等[39]基于3D-rGO/AuNPs開發(fā)了用于測定As3+的新型電化學適配體傳感器，如圖1所示，將3D-rGO/AuNPs滴涂修飾到玻碳電極上，再在Au-S共價鍵作用下將5′-硫代適配體修飾到3D-rGO/AuNPs的表面，當存在靶標物As3+時，5′-硫代適配體與As3+結(jié)合形成G-4分體結(jié)構(gòu)，阻礙反應體系的電子轉(zhuǎn)移，使得電化學阻抗譜的信號增加。在最佳檢測條件下，該電化學適配體傳感器對As3+的檢出限(1.4×10-7ng/mL)極低，線性范圍為3.8×10-7～3.0×10-4ng/mL，并已成功地用于實際水樣中As3+的測定(自來水，河水和廢水中的加標回收率為96%～104%)。此外，所開發(fā)的基于3D-rGO/AuNPs的電化學適配體傳感器具有良好的的選擇性(高濃度的其他金屬離子如Zn2+、Ag+和As5+等不影響As3+的測定)和重現(xiàn)性(相對標準偏差為2%)?；诩{米材料的電化學適配體傳感器具有靈敏度高、設備簡單、易微型化、選擇性強的優(yōu)點，但檢測的穩(wěn)定性有待進一步提高。

圖1 電化學適配體傳感器的示意圖[39]Fig.1 The mechanism reaction of the proposed electrochemical aptasensor[39]

2.2 基于納米材料的熒光適配體傳感器

近年來，基于納米材料的熒光適配體傳感器在分析化學領(lǐng)域中備受研究者們的關(guān)注[40]，被認為是一種重要的重金屬檢測工具。

SUN等[41]基于磁分離和T-Hg2+-T堿基對的形成，開發(fā)了用于Hg2+檢測的熒光適配體傳感器。如圖2所示，鏈霉親和素修飾的磁珠會在鏈霉親和素-生物素的強相互作用下捕獲生物素修飾的適配體形成適配體功能化的磁珠，在沒有Hg2+的情況下，熒光標記的信號轉(zhuǎn)導探針可以通過堿基互補配對與適配體功能化的磁珠結(jié)合。磁分離后的檢測溶液中幾乎沒有熒光標記的信號轉(zhuǎn)導探針，導致熒光信號弱。當溶液中存在Hg2+時，Hg2+會誘導適配體和輔助DNA之間形成T-Hg2+-T堿基對。通過磁分離去除適配體功能化的磁珠后，溶液中會殘留一定量的熒光標記的信號轉(zhuǎn)導探針，導致熒光信號顯著增強。該傳感器的線性范圍為2～160 nmol/L，檢出限為0.2 nmol/L，已成功的用于河水和帶魚中Hg2+的測定(回收率為92.94%～105.16%，變異系數(shù)為0.44%～0.94%)。ZHAO等[42]利用石墨烯QDs的良好生物相容性和強熒光性，石墨烯QDs和GO之間獨特的電子轉(zhuǎn)移引起的熒光猝滅以及G-4/Pb2+復合物的形成而導致的熒光恢復來實現(xiàn)Pb2+的定量分析。該熒光適配體傳感器檢測時間短(1 min)、線性范圍寬(9.9～435 nmol/L)，且對Cd2+、Ag+、Cu2+、Hg2+等干擾離子表現(xiàn)出良好的選擇性。

WU等[43]提出了一種基于QDs和DNA酶的熒光適配體傳感器，用于Pb2+和Cu2+的高靈敏、高選擇性檢測。在沒有目標金屬離子Pb2+和Cu2+的情況下，DNA酶與底物在堿基互補配對的作用下結(jié)合，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移，DNA酶上標記的猝滅劑可以有效地猝滅QDs的熒光。在Pb2+和Cu2+存在時，金屬離子會優(yōu)先與DNA酶結(jié)合，使得底物和DNA酶遠離QDs的表面，反應體系的熒光恢復。該傳感器的線性范圍為1～50 nmol/L，Pb2+和Cu2+的檢出限分別為0.2 nmol/L和0.5 nmol/L?？偟膩碚f，基于納米材料的熒光適配體傳感器可以實現(xiàn)重金屬離子的快速、高靈敏和高特異性測定，但熒光信號容易受到檢測體系共存物的干擾，影響測定的準確性。

2.3 基于納米材料的比色適配體傳感器

基于納米材料的比色適配體傳感器具有無需儀器的可視化潛力、實驗成本低、操作簡單等特點[44-45]，已成為不同種類重金屬離子檢測最理想的方法之一。

AuNPs是一種經(jīng)典的貴金屬納米材料，具有較高的消光系數(shù)且在不同聚集態(tài)時會產(chǎn)生不同的顏色變化[46]，被廣泛用于比色適配體傳感器的構(gòu)建中。WU等[29]利用AuNPs這種獨特的性能，開發(fā)了用于Cd2+測定的比色法。當不存在Cd2+時，適配體與二烯丙基二甲基氯化銨(poly dimethyl ammonium chloride,PDDA)結(jié)合形成“雙鏈體”結(jié)構(gòu)，溶液中的AuNPs由于缺乏PDDA而無法聚集，此時溶液的顏色是酒紅色。當溶液中存在靶標物Cd2+時，適配體優(yōu)先與Cd2+結(jié)合，游離的PDDA會聚集AuNPs，溶液的顏色從酒紅色變成藍色。TAGHDISI等[47]開發(fā)了一種基于聚乙烯亞胺和AuNPs的比色適配體傳感器(圖3)，用于Pb2+的選擇性檢測。在沒有Pb2+的情況下，適配體在靜電作用下與聚乙烯亞胺結(jié)合，導致聚乙烯亞胺的數(shù)量不足以誘導AuNPs的聚集，溶液為酒紅色。加入Pb2+后，適配體的構(gòu)像發(fā)生變化，形成G-4/Pb2+復合物，游離的帶正電荷的聚乙烯亞胺會誘導AuNPs聚集，溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{色。該傳感器的線性范圍為0～10 nmol/L，檢出限為702 pmol/L，并已成功應用于大鼠血清和自來水中Pb2+的檢測。此外，研究表明，銀染色的增強效應很大程度上取決于AuNPs的數(shù)量和分散狀態(tài)[48-49]。當AuNPs分散時，每個AuNPs都暴露在銀增強溶液中，導致AuNPs的表面積大得多，從而催化在單位時間內(nèi)減少更多的銀離子，溶液顏色較深。然而，當AuNPs聚集時，只有外部的AuNPs暴露在外，因此催化的銀離子減少，溶液顏色較淺?；谶@一現(xiàn)象，CHEN等[50]構(gòu)建了用于Hg2+檢測的比色適配體傳感器，在Hg2+存在時，適配體功能化的AuNPs由于T-Hg2+-T復合物的形成而聚集在一起，導致在著色過程中暴露銀離子的AuNPs表面積大大降低，因此，溶液的顏色較淺。當不存在Hg2+時，適配體功能化的AuNPs分散暴露于銀增強溶液中，此時溶液顏色較深。該比色傳感器的線性范圍為1～500 nmol/L，且對干擾離子(Cd2+、Ag+、Cu2+等)表現(xiàn)出良好的特異性。與其他分析方法相比，基于納米材料的比色適配體傳感器無需復雜的設備，可以直接通過肉眼觀察到的顏色變化來檢測重金屬，更有利于實現(xiàn)樣品的原位實時快速篩查，但其檢測的靈敏度較低，且容易受到樣品基質(zhì)的干擾。

圖3 基于聚乙烯亞胺和AuNPs的比色適配體傳感器， 用于Pb2+的檢測[47]Fig.3 Schematic diagram of colorimetric aptasensor based on polyethyleneimine and AuNPs for Pb2+ detection[47]

2.4 基于納米材料的SERS適配體傳感器

SERS是一種強大的振動光譜技術(shù)，可通過放大由局部表面等離子體激發(fā)而產(chǎn)生的電磁場，對低濃度分析物進行快速、無損和痕量化學檢測[51-52]。近年來，將納米材料應用于SERS適配體傳感器中可極大地提高檢測靈敏度，已成為適配體傳感領(lǐng)域一個重要的研究方向。

DU等[53]提出了一種便攜式高靈敏SERS適配體傳感器，4,4-聯(lián)吡啶(4,4-bipyridine,DPY)分子有2個對稱形式的吡啶環(huán)，這兩個富含電子的氮原子可以結(jié)合到Au@Ag納米顆粒的銀殼上，當溶液中存在Hg2+時，DPY會優(yōu)先與Hg2+結(jié)合并從Au@Ag納米顆粒上釋放出來，從而淬滅DPY的SERS信號。該SERS適配體傳感器的線性范圍為1.0×10-14～1.0×10-10mol/L，檢出限為1.0×10-14mol/L，在牛奶、橙汁和湖水中的加標回收率為98.33%～107.77%。具有可回收利用、每次測試只需要非常少量的樣本(20 μL)、耗時短(在4 min內(nèi)即可完成檢測)、成本低廉等優(yōu)點。LU等[54]開發(fā)了基于T-Hg2+-T堿基對和SiO2@Au核殼結(jié)構(gòu)的SERS適配體傳感器，用于水溶液中Hg2+的超靈敏和選擇性測定。如圖4所示，在Au-S共價鍵作用下將富含T的適配體固定在SiO2@Au核殼納米顆粒的表面上，加入Hg2+后，Hg2+可以特異性的結(jié)合適配體上的T堿基形成T-Hg2+-T堿基對，使得固定SiO2@Au核殼表面上的適配體方向由平行變?yōu)榇怪?，拉曼強度比I(660 cm-1)/I(736 cm-1)隨著Hg2+濃度的增加而增加。該基于納米材料的SERS適配體傳感器的線性范圍為1×10-8～1×10-3mol/L，檢出限低至10 nmol/L，且對Zn2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+等干擾離子表現(xiàn)出良好的選擇性。基于納米材料的SERS適配體傳感器可以實現(xiàn)重金屬離子的高選擇性、便攜式和超靈敏檢測，但一般需要外部拉曼標記，這必然會增加檢測系統(tǒng)的成本和復雜性。

圖4 用于Hg2+測定的無標記SERS適配體傳感器 示意圖[54]Fig.4 Schematic representation of the label-free SERS aptasensor detection method for Hg2+ detection[54]

3 結(jié)語

納米材料具有獨特的光學、電子和催化性質(zhì)，是用于固定化分子識別元件-適配體的有效材料。結(jié)合納米材料的適配體傳感器在重金屬分析檢測中具有快速、靈敏度高和選擇性強等優(yōu)勢，在重金屬檢測領(lǐng)域具有很強的發(fā)展?jié)撡|(zhì)。然而，目前文獻報道的重金屬適配體主要集中在Pb2+、Hg2+、Cd2+、Ag+、As3+上，仍有許多重金屬缺乏適配體，未來需進行大量的適配體篩選工作；在重金屬分析檢測中，多數(shù)研究的適配體只針對一種靶標物，未來應加強多種靶標物的同時、高效、準確檢測；此外，多種結(jié)合納米材料的適配體傳感器還未能實現(xiàn)現(xiàn)場復雜樣品的實時檢測，未來應加強高靈敏重金屬傳感器及小型便攜式商業(yè)快檢設備、產(chǎn)品的研發(fā)。