郭佳，李云飛，李詩(shī)佳，關(guān)紅霞，陳曉光*

1(長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué) 人文信息學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春，130122)2(長(zhǎng)春工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春，130012)

酸漿(PhysalisalkekengiL.)早在《本草綱目》中就有記載，其具有化痰、利濕除熱和清肺止咳等功效。近代研究表明酸漿富含甾體類和黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌和防治糖尿病等功效[1-3]。有關(guān)其宿萼(calyx physalis，Cps)的研究相對(duì)較少，其主要化學(xué)成分為酸漿苦素和黃酮類等化合物[4]。酸漿宿萼提取物能夠抑制小鼠胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增強(qiáng)小鼠免疫能力、顯著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖含量并對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有顯著的抑菌效果。此外，酸漿宿萼總皂苷能增加抑癌相關(guān)基因caspase-3、細(xì)胞色素C、Bax的表達(dá),促進(jìn)人的SMMC-7721肝癌細(xì)胞的凋亡，體現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用[5]。酸漿苦素對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞和前列腺LNcAP細(xì)胞株具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性[6-7]。然而，其在抗衰老方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。目前，有關(guān)衰老的研究仍然處于對(duì)衰老的認(rèn)識(shí)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，關(guān)于衰老的學(xué)說(shuō)主要有“端粒學(xué)說(shuō)”、“自身免疫學(xué)說(shuō)”和“自由基學(xué)說(shuō)”等，其中自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為生物體內(nèi)活性氧自由基含量水平過(guò)高會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不同程度的氧化損傷，最終導(dǎo)致并加快衰老[8-9]。因此，通過(guò)藥物合理降低衰老過(guò)程中生物機(jī)體內(nèi)活性氧自由基的水平，成為抗衰老的重要途徑之一。秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans，以下簡(jiǎn)稱線蟲(chóng))，由于其具有繁殖能力強(qiáng)、易于保存、遺傳背景清晰、與人類基因同源性高、信號(hào)通路保守等特點(diǎn)，被作為模式動(dòng)物廣泛應(yīng)用于抗氧化、抗衰老等實(shí)驗(yàn)研究[10-13]。在已有報(bào)道中，茶多酚等多酚類物質(zhì)能夠通過(guò)上調(diào)線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化相關(guān)基因，降低線蟲(chóng)體內(nèi)活性氧自由基的水平，延緩線蟲(chóng)衰老[14-17]。本文以線蟲(chóng)為模式動(dòng)物，系統(tǒng)探究酸漿宿萼水提物的抗衰老生物學(xué)活性，并以胡桃醌為氧化劑構(gòu)建體內(nèi)抗氧化活性檢測(cè)體系，評(píng)價(jià)了不同濃度酸漿宿萼水提物的體內(nèi)抗氧化生物活性，進(jìn)一步闡明其作用機(jī)理。本研究數(shù)據(jù)增加了人們對(duì)酸漿宿萼生物學(xué)作用的認(rèn)識(shí)，為合理利用酸漿宿萼以及抗衰老藥物的研發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 酸漿宿萼水提物的制備

酸漿宿萼采摘于長(zhǎng)春八一水庫(kù)，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張鳳瑞教授鑒定為茄科植物酸漿的宿萼。取酸漿宿萼58.81 g，100 ℃水煮40 min，反復(fù)3次，合并水煮液，共得3 900 mL水煮液。取水煮液1 900 mL置于70 ℃ 水浴鍋中濃縮，最終1 g濃縮液含1.7 g主藥。將濃縮液在無(wú)菌操作臺(tái)中分裝于10 mL無(wú)菌離心管中，-20 ℃凍存。

1.1.2 酸漿宿萼水提物主要成分

根據(jù)已有文獻(xiàn)中的方法對(duì)酸漿宿萼水提物中多糖、總酚和總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定[18-19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)1 g酸漿宿萼水提物中多糖、總酚和總黃酮含量分別為0.63 g、1.35 mg和1.22 mg。

1.1.3 秀麗隱桿線蟲(chóng)蟲(chóng)株

野生型線蟲(chóng)N2 (Bristol)，突變體線蟲(chóng)clk-1(qm30)、daf-2(e1368)、eat-2(ad1116), 購(gòu)于Caenorhabditis Genetics Center (CGC)。

1.1.4 試劑

蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉、酵母提取物，生工生物工程股份有限公司；DPPH、ABTS、胡桃醌(ST79990120MG-25 mg), 薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.1.5 儀器與設(shè)備

DSPM-508生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；YM-COS-100C水平恒溫?fù)u床，上海豫明儀器有限公司；SW-CJ-2F無(wú)菌雙人超凈臺(tái)，浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司；SMZ168體式顯微鏡，麥克奧迪科技有限公司；PCR max Eco 48 熒光定量PCR儀，上海睿玥實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cps對(duì)線衰老指標(biāo)的影響

壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Cps能夠顯著延長(zhǎng)野生型N2線蟲(chóng)的壽命，質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)效果最佳(圖1-A)，但對(duì)飲食限制信號(hào)通路突變體線蟲(chóng)eat-2的壽命無(wú)明顯影響(圖1-B)，Cps顯著增加N2線蟲(chóng)的蟲(chóng)體擺動(dòng)次數(shù)(圖1-C、1-D)、產(chǎn)卵量(圖1-E、1-F)和吞咽頻率(圖1-G、1-H)。

A-N2線蟲(chóng)壽命實(shí)驗(yàn)；B-突變體線蟲(chóng)壽命實(shí)驗(yàn)；C～D-線蟲(chóng)擺動(dòng)實(shí)驗(yàn)；E～F-線蟲(chóng)生殖實(shí)驗(yàn)；G～H-線蟲(chóng)吞咽頻次試驗(yàn)圖1 酸漿宿萼水提物對(duì)N2線蟲(chóng)壽命和生理功能的影響Fig.1 Effects of Cps on the life span and physiological function of N2 worms注：*代表P<0.05;**代表P<0.01；***P<0.001(n≥30)(下同)

2.2 Cps對(duì)野生型N2線蟲(chóng)應(yīng)激能力的影響

線蟲(chóng)暴露于含有胡桃醌的培養(yǎng)基或者紫外輻射和高溫等不利環(huán)境中時(shí)，能夠?qū)е戮€蟲(chóng)體內(nèi)活性氧自由基水平急速上升，造成氧化所傷，導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡[21]。因此，可通過(guò)觀察Cps對(duì)野生型線蟲(chóng)N2在上述條件下存活時(shí)間的影響評(píng)價(jià)其抗氧化生物活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.1 mg/mL Cps具有顯著的抗氧化作用，能夠減少200 μmol/L胡桃醌(圖2-A)、紫外輻射(圖2-B)和熱應(yīng)激(圖2-C)所誘導(dǎo)的氧化損傷，延長(zhǎng)N2線蟲(chóng)存活時(shí)間，具有顯著的體內(nèi)抗氧化生物活性。

A-氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)；B-紫外輻射實(shí)驗(yàn)；C-熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)圖2 Cps對(duì)N2線蟲(chóng)應(yīng)激能力的影響Fig.2 Effects of Cps on stress ability of N2 worms

2.3 Cps對(duì)突變體線蟲(chóng)抗氧化應(yīng)激能力的影響

突變體線蟲(chóng)氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cps能夠顯著增加線粒體信號(hào)通路突變體線蟲(chóng)clk-1(圖3-A)和胰島素信號(hào)通路突變體線蟲(chóng)daf-2(圖3-B)的抗氧化應(yīng)激能力，延長(zhǎng)其存活時(shí)間，但是對(duì)飲食限制信號(hào)通路突變體線蟲(chóng)eat-2的存活時(shí)間無(wú)明顯影響 (圖3-C)。

2.4 Cps對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)氧自由基的水平影響

為了進(jìn)一步探究Cps對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)氧自由基水平的影響，采用綠色熒光染料2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA )對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)的活性氧自由基進(jìn)行染色，評(píng)價(jià)線蟲(chóng)體內(nèi)活性氧自由基的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥組線蟲(chóng)熒光強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組，Cps能夠顯著降低線蟲(chóng)體內(nèi)活性氧自由基的水平(圖4)。

A-實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)；B-熒光總強(qiáng)度差異性分析圖4 Cps對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)氧自由基水平的影響Fig.4 Effects of Cps on the level of oxygen free radicals in the worms

2.5 Cps對(duì)經(jīng)典抗氧化酶和靶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，Cps能夠顯著提高超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)的活性以及經(jīng)典抗氧化基因gst-4、gst-7、sod-3、daf-16的轉(zhuǎn)錄水平(圖5)。

A-SOD和CAT酶活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)；B-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5 Cps對(duì)抗氧化酶和基因轉(zhuǎn)錄水平影響Fig.5 Effect of Cps on the antioxidant enzyme and gene of worms

2.6 Cps對(duì)大腸桿菌OP50(尿嘧啶缺陷型大腸桿菌(Escherichia coli OP50)增殖的影響

通過(guò)菌增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了0.1 mg/mL的酸漿宿萼水提物對(duì)線蟲(chóng)食物大腸桿菌OP50增殖的影響，如圖6所示，0.1 mg/mL的酸漿宿萼水提物對(duì)大腸桿菌OP50增殖無(wú)影響。

圖6 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curve of Escherichia coli OP50

3 討論

高水平的活性氧是有氧代謝的副產(chǎn)物，會(huì)破壞許多大分子，如DNA、脂類和蛋白質(zhì)?；钚匝醯漠a(chǎn)生和清除之間的不平衡使各種氧自由基逃逸并破壞許多大分子。這種損傷被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致生理功能的加速下降和死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加。因此，合理采用藥物干預(yù)生物體內(nèi)的自由基水平成為延緩衰老的途徑之一。

本實(shí)驗(yàn)采用秀麗隱桿線蟲(chóng)為模式動(dòng)物系統(tǒng)探究酸漿宿萼水提物對(duì)線蟲(chóng)衰老的影響。同空白對(duì)照組相比，酸漿宿萼水提物能夠顯著延長(zhǎng)野生型線蟲(chóng)N2的壽命，增加線蟲(chóng)產(chǎn)卵數(shù)目和吞咽頻率，體現(xiàn)出顯著的抗衰老作用。同時(shí)，能夠顯著提高線蟲(chóng)抗氧化應(yīng)激能力，降低來(lái)自胡桃醌、紫外輻射和熱應(yīng)激所誘導(dǎo)的氧化損傷和線蟲(chóng)體內(nèi)活性氧自由基的水平，提高SOD和CAT活力，體現(xiàn)出顯著的體內(nèi)抗氧化生物活性。這一結(jié)果同“自由基學(xué)說(shuō)”相吻合，推測(cè)其抗衰老作用源于其所具有的體內(nèi)抗氧化生物活性相關(guān)。同時(shí)，在突變體線蟲(chóng)壽命和氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，Cps不影響飲食限制信號(hào)通路突變體線蟲(chóng)eat-2的壽命和抗氧化應(yīng)激能力，進(jìn)一步證明Cps的抗衰老生物活性同飲食限制信號(hào)通路相關(guān)。在已有研究中，飲食限制信號(hào)通路的激活將會(huì)上調(diào)相關(guān)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而增強(qiáng)線蟲(chóng)的抗氧化應(yīng)激能力，延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命[22-25]。本實(shí)驗(yàn)中，Cps能夠顯著上調(diào)經(jīng)典抗氧化基因gst-4、sod-3、daf-16和熱抗性基因hsp-16.2的轉(zhuǎn)錄水平，與已有研究結(jié)果相符。但是，已有研究表明，飲食限制信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致線蟲(chóng)產(chǎn)卵數(shù)目下降，產(chǎn)卵周期延長(zhǎng)。然而在本實(shí)驗(yàn)中，Cps顯著增加了線蟲(chóng)產(chǎn)卵數(shù)目，對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)卵周期無(wú)顯著影響，其原因可能是Cps不完全依賴于飲食限制信號(hào)通路，其他信號(hào)通路的激活導(dǎo)致了線蟲(chóng)產(chǎn)卵數(shù)目的增加。此外，適當(dāng)?shù)酿囸I同樣能夠激活飲食限制信號(hào)通路[26]，為此，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Cps對(duì)線蟲(chóng)食物大腸桿菌OP50增值的影響，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)濃度的Cps不影響大腸桿菌OP50的增值，證明Cps所體現(xiàn)出的生物活性同大腸桿菌OP50增值無(wú)關(guān)。

綜上，Cps(0.1 mg/mL)能夠延緩線蟲(chóng)衰老，具有顯著的抗衰老作用，其作用機(jī)理可能通過(guò)激活飲食限制信號(hào)通路，上調(diào)相關(guān)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)線蟲(chóng)抗氧化應(yīng)激能力，降低線蟲(chóng)衰老過(guò)程中體內(nèi)活性氧自由基的水平，進(jìn)而減少氧化損傷，延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命。本文為酸漿宿萼的開(kāi)發(fā)利用及生物活性進(jìn)一步研究提供借鑒，為抗衰老藥物的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。