朱俊成，馮鑫，李璐思，馬良, 2，戴宏杰, 2，付余, 2，黃少林，張宇昊, 2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶， 400715)2(西南大學(xué)，食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶， 400715)

明膠是由動(dòng)物皮膚、骨等結(jié)締組織中的膠原蛋白不完全降解而成的強(qiáng)親水性蛋白，因其良好的成膜性、膠凝性、乳化性和生物相容性以及低成本和無(wú)毒性等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品，生物制藥及化妝品等領(lǐng)域[1-4]。例如，李媛等[5]利用明膠和迷迭香酸復(fù)配成功制備了復(fù)合膜，結(jié)果表明，將迷迭香酸引入明膠膜，可有效抑制豬肉貯藏過(guò)程中揮發(fā)性鹽基氮含量和菌落總數(shù)的上升，且隨著迷迭香酸濃度的增加，抑制效果明顯增強(qiáng)。FENG等[6-7]以京尼平為交聯(lián)劑制備了食品級(jí)明膠納米顆粒，并用于穩(wěn)定Pickering乳液。在本課題組前期的研究中，利用微波和液氮快速的凍融耦合誘導(dǎo)明膠化，且用微波輔助進(jìn)行明膠的提取[8-9]。然而，明膠經(jīng)過(guò)熱風(fēng)干燥后容易產(chǎn)生不悅氣味以及不良顏色。因此，尋找一種新的明膠干燥方法具有重要意義。

近年來(lái)，真空冷凍干燥和噴霧干燥因其簡(jiǎn)單、低成本、高效率、可重復(fù)擴(kuò)大生產(chǎn)以及最大程度減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于食品物料的干燥中[10-12]。例如，KHASHAYAR等[13]評(píng)價(jià)了殼聚糖涂層對(duì)噴霧干燥固化前后亞麻籽肽組分納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性的增強(qiáng)作用。因此，將真空冷凍干燥和噴霧干燥應(yīng)用于明膠，以減少干燥過(guò)程中的不良變化，對(duì)綠色明膠的工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。然而，在干燥過(guò)程中，能量或熱量的輸入通常會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的理化和功能特性的改變[14]。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵被能量破壞將導(dǎo)致蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)發(fā)生明顯變化，極大地影響了蛋白質(zhì)的溶解度、凝膠化、起泡性、乳化性等功能性質(zhì)，這進(jìn)一步影響了蛋白質(zhì)在工業(yè)化中的應(yīng)用[15-16]。例如，SALEM等[17]研究表明噴霧干燥可改善明膠的起泡性、乳化性以及保水保油性，并提高凝膠強(qiáng)度和玻璃轉(zhuǎn)移溫度。然而，目前關(guān)于熱風(fēng)干燥、真空冷凍干燥和噴霧干燥對(duì)微波液氮快速凍融耦合提取明膠理化性質(zhì)的影響還沒(méi)有被系統(tǒng)地研究。

因此，本研究聚焦于熱風(fēng)干燥、真空冷凍干燥和噴霧干燥對(duì)明膠的理化性質(zhì)的影響，包括得率、顏色、凝膠強(qiáng)度、凝膠持水力、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)、疏水性以及傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)。本研究旨在完善明膠的綠色制備方法，以期為綠色明膠的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大眼金槍魚(yú)皮,山東中魯遠(yuǎn)洋食品有限公司慷慨；十二烷基苯磺酸鈉(sodium dodecyl benzene sulfonate,SDBS)、溴化鉀、硫酸鋁、氧化鎂、磷酸，成都科龍化學(xué)試劑廠;4×蛋白緩沖溶液(含二硫蘇糖醇)、Tris、考馬斯亮藍(lán)R-250、四甲基乙二胺，美國(guó)Bio Basic公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%丙烯酰胺， 北京索萊寶科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白 (分子質(zhì)量為10～200 kDa)， 加拿大Fermentas公司。其中Tris、考馬斯亮藍(lán)R-250、30%丙烯酰胺為優(yōu)級(jí)純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA3003B電子天平,上海精天電子儀器有限公司;QL 901 Vortex漩渦混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″?上海新諾儀器設(shè)備有限公司;Heraeus Multifuge X3R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),美國(guó)賽默飛世爾科技公司;MAS-II plus微波合成萃取反應(yīng)工作站，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;DGG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;FD-1-50真空冷凍干燥機(jī)，中國(guó)北京博益康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;KQ-100B超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司;YC-510噴霧干燥器，中國(guó)上海亞誠(chéng)儀器設(shè)備有限公司;UltraScan-PRO測(cè)色儀，美國(guó)Hunter Lab公司;TA.XT2i物性測(cè)定儀，英國(guó)Stable Micro Systems公司;F- 4500熒光分光光度計(jì)，日本日立公司;Spectrun100紅外光譜儀，美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.3 魚(yú)皮的準(zhǔn)備

參考杜杰等[9]的方法將魚(yú)皮去除脂肪和非膠原蛋白備用。新鮮魚(yú)皮在去除魚(yú)鱗和魚(yú)肉后清洗干凈，切成小塊(4 mm×4 mm)。在超聲(120 W，25 ℃，2 h)條件下，加入2倍體積0.75%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的SDBS溶液去除脂肪。然后，將清潔后的魚(yú)皮與6倍體積1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl混合，攪拌6 h以除去雜蛋白，每隔 2 h 更換1次NaCl溶液。最后，用去離子水沖洗魚(yú)皮，放入聚乙烯袋中并在-20 ℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 明膠的提取

將25 g魚(yú)皮與6倍體積去離子水混合，在微波(75 ℃，350 W，270 r/min)下攪拌15 min。然后，將魚(yú)皮濾出，濾液備用，用液氮快速冷凍魚(yú)皮，之后放入濾液中，在30 ℃水浴條件下攪拌解凍。將魚(yú)皮與濾液混合物轉(zhuǎn)移至微波提取容器中，以1∶50的質(zhì)量比加入6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的硅藻土溶液。然后，用微波加熱60 min(55 ℃，350 W，270 r/min)提取明膠。為了獲得澄清的明膠，用9.8%(體積分?jǐn)?shù))的H3PO4調(diào)節(jié)濾液的pH至5.5，然后加入3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Al2(SO4)3并在70 ℃攪拌30 min，最后在13 000×g下離心30 min收集上清液(150 mL)用于干燥。(1)熱風(fēng)干燥明膠(hot air drying gelatin,HDG)：將上清液倒入塑料盤中，然后在60 ℃的熱風(fēng)中24 h得到干燥明膠。(2)真空冷凍干燥明膠(vacuum freeze drying gelatin,VDG)：將上清液在-20 ℃下冷凍2 h后進(jìn)行真空冷凍干燥。(3)噴霧干燥明膠(spray daying gelatin,SDG)：蠕動(dòng)泵速度為10，入口溫度160 ℃，出口溫度100 ℃。明膠得率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.5 色差測(cè)試

采用色差儀對(duì)明膠的色差進(jìn)行測(cè)定，分別記錄L*值(亮度值)、a*值(紅度值)和b*值(黃度值)。

1.6 凝膠強(qiáng)度測(cè)定

將1 g明膠與15 mL蒸餾水混合，然后在60 ℃恒溫?cái)嚢杷″佒腥芙?.5 h，以獲得6.67%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))明膠溶液。將明膠溶液倒入膠凍杯中(直徑54 mm，高度60 mm)，并在4 ℃下冷卻16 h。使用物性測(cè)定儀測(cè)定凝膠樣品的凝膠強(qiáng)度，探頭采用P/0.5，測(cè)試速度為1.0 mm/s，觸發(fā)力為5 g，下壓距離為4 mm。

1.7 持水力測(cè)定

參考WANG等[18]的方法進(jìn)行持水力(water holding capacity，WHC)測(cè)定。將凝膠樣品(10 g)在25 ℃下于5 000×g下離心10 min。凝膠的WHC定義為離心后凝膠質(zhì)量相對(duì)于離心前凝膠質(zhì)量的百分比。

1.8 電泳測(cè)定

參考MA等[19]的方法通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定明膠樣品的分子質(zhì)量分布。在60 ℃水浴條件下，將干明膠溶解到蒸餾水中，使最終明膠溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%。按照V(樣品)∶V(上樣緩沖液)=3∶1，添加還原性上樣緩沖液，渦旋后煮沸5 min，立即冷卻上樣，上樣量15 μL，Marker 10 μL，電泳分離膠和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6%和5%，電流設(shè)置為15 mA，當(dāng)藍(lán)色條帶跑到分離膠中時(shí)將電流調(diào)至25 mA，待條帶跑到綠色底部即可停止電泳。流動(dòng)水下取出電泳膠，加入考馬斯亮藍(lán)R-250染色2 h后脫色至條帶清晰，在電泳燈上觀察明膠分子質(zhì)量分布。

1.9 疏水性測(cè)定

參考曾茂茂等[20]采用熒光探針?lè)y(cè)定明膠的疏水性。以熒光強(qiáng)度對(duì)明膠的濃度作曲線，以曲線的斜率表示明膠的表面疏水性(H0)。

1.10 FTIR測(cè)定

參考DAI等[21]的方法進(jìn)行FTIR測(cè)試。將明膠粉末和溴化鉀粉末按照質(zhì)量比1∶400在瑪瑙研缽中充分研磨，至混合粉末無(wú)顆粒感，于40 ℃熱風(fēng)干燥箱中烘干12 h后壓成薄片，使用Spectrum 100紅外光譜儀在4 000～400 cm-1以4 cm-1的分辨率掃描32次。

1.11 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立進(jìn)行3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。利用SPSS Statistics 17.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行顯著性分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 得率分析

不同干燥方式對(duì)明膠得率的影響如圖1所示。HDG、VDG和SDG的得率分別為25.56%、26.85%和22.17%，表明熱風(fēng)干燥和真空冷凍干燥的明膠得率顯著高于噴霧干燥(P<0.05)。SDG較低的得率可能與明膠在噴霧干燥室的貼壁行為以及渦旋分離的損失有關(guān)[22]。此外，HDG和VDG沒(méi)有顯著的差異(P>0.05)，說(shuō)明在熱風(fēng)干燥和真空冷凍干燥過(guò)程中沒(méi)有較大的損失[23]。

圖1 不同干燥方式對(duì)明膠得率的影響Fig.1 Effect of different drying methods on the yield of gelatin注：不同小寫(xiě)字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 色差分析

明膠的顏色不會(huì)影響其功能性質(zhì)，但會(huì)在食品加工過(guò)程中影響食品本身的顏色，最終影響食品的感官質(zhì)量[24]。從圖2可以看出，真空冷凍干燥和噴霧干燥可以明顯地減少明膠變黃，提高明膠的白度。表1顯示了不同干燥方式對(duì)明膠顏色參數(shù)(L*，a*，b*)的影響。結(jié)果表明，VDG和SDG的L*顯著高于HDG，尤其是SDG的白度最大，這可能與噴霧干燥過(guò)程中溶劑快速蒸發(fā)以減少蛋白的氧化有關(guān)[25]。此外，真空冷凍干燥和噴霧干燥能顯著降低a*和b*值。顏色的變化可能是由干燥過(guò)程中氨基酸的美拉德反應(yīng)引起的。因此，真空冷凍干燥和噴霧干燥能顯著降低美拉德反應(yīng)的程度，改善熱風(fēng)干燥產(chǎn)生的不良色澤，與明膠的直觀結(jié)果保持一致。

圖2 不同干燥方式對(duì)明膠外觀的影響Fig.2 Effect of different drying methods on the visual appearance of gelatin

表1 不同干燥方式對(duì)明膠顏色參數(shù)的影響Table1 Effect of different drying methods on the color parameters of gelatin

2.3 電泳分析

不同干燥方式對(duì)明膠SDS-PAGE的影響如圖3所示，所有明膠樣品均顯示α1帶和α2帶。與SDG相比，HDG中α帶強(qiáng)度明顯降低，VDG略微降低。此外，HDG的低分子質(zhì)量(50 kDa)明顯高于其他組。結(jié)果表明，明膠分子在長(zhǎng)時(shí)間熱風(fēng)干燥后發(fā)生明顯的降解，但低于真空冷凍干燥和噴霧干燥，可能的原因是真空冷凍干燥條件相對(duì)溫和，一定程度減輕了明膠的降解，而噴霧干燥是一個(gè)快速的過(guò)程，抑制明膠在干燥過(guò)程中的降解。

圖3 不同干燥方式對(duì)明膠SDS-PAGE的影響Fig.3 Effect of different drying methods on the SDS-PAGE of gelatin

2.4 凝膠強(qiáng)度分析

不同干燥方式對(duì)明膠凝膠強(qiáng)度的影響如圖4所示。相比HDG(153.62 g)，SDG表現(xiàn)出最高的凝膠強(qiáng)度值(239.90 g)，VDG次之(200.82 g)，所有明膠均達(dá)到國(guó)標(biāo)要求(GB 6783—2013規(guī)定明膠的凝膠強(qiáng)度≥ 50 g)[9]。VDG和SDG的凝膠強(qiáng)度較高與明膠中的高分子亞基含量較高有關(guān)，高分子亞基更有利于有效地排列或自聚集，形成密集的網(wǎng)絡(luò)，從而導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度的增加[22]；而較多的小分子亞基形成的網(wǎng)絡(luò)較為疏松，進(jìn)而降低了明膠的凝膠強(qiáng)度，與電泳結(jié)果一致。此外，所有明膠的凝膠強(qiáng)度值低于杜杰等[9]研究(524.40 g)，可能的原因是明膠溶液中高分子亞基在離心過(guò)程中發(fā)生凝聚而沉淀[26]，導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度的降低。

圖4 不同干燥方式對(duì)明膠凝膠強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of different drying methods on the gel strength of gelatin

2.5 凝膠持水力分析

不同干燥方式對(duì)凝膠持水力的影響如圖5所示。相比HDG(85.36%)，SDG表現(xiàn)出最高的凝膠持水力(96.12%)，VDG次之(92.85%)。VDG和SDG的凝膠持水力較高，這與明膠中高分子亞基含量較高有關(guān)，高分子亞基更有利于有效地排列或自聚集，形成密集的網(wǎng)絡(luò)，從而提高了凝膠的持水力。而較多小分子亞基形成的網(wǎng)絡(luò)較為松散，則降低了凝膠的持水力[18]，與電泳結(jié)果和凝膠強(qiáng)度結(jié)果保持一致。

圖5 不同干燥方式對(duì)凝膠持水力的影響Fig.5 Effect of different drying methods on the WHC of gel

2.6 疏水性分析

蛋白質(zhì)的疏水性是影響其功能性質(zhì)的重要參數(shù)[27]。不同干燥方式對(duì)明膠疏水性的影響如圖6所示。HDG、VDG和SDG的H0值分別為57.68，61.77和80.08，說(shuō)明真空冷凍干燥和噴霧干燥后明膠的親水性降低，疏水性增強(qiáng)，SDG表現(xiàn)出最強(qiáng)的疏水性，這可能是由于噴霧干燥過(guò)程中暴露了更多的疏水基團(tuán)。此外，與HDG和VDG相比，SDG在圖3中顯示了更多的亞基(α1、α2和一些小分子亞基)，它們可能具有更多的疏水氨基酸，從而提高了明膠的疏水性[22]。因此，噴霧干燥可使明膠的疏水性增加，這可能更有利于明膠功能性質(zhì)的改善。

圖6 不同干燥方式對(duì)明膠疏水性的影響Fig.6 Effect of different drying methods on the hydrophobicity of gelatin

2.7 FTIR分析

圖7 不同干燥方式對(duì)明膠FTIR的影響Fig.7 Effect of different drying methods on the FTIR of gelatin

如表2所示，SDG在酰胺A帶的波數(shù)最低，表明噴霧干燥增加了N—H基團(tuán)的數(shù)量，更多的N—H基團(tuán)參與了氫鍵的形成[28-29]，這更有利于明膠在凝膠形成過(guò)程中類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)而增加其凝膠強(qiáng)度[30]。然而，SDG的酰胺B帶顯示出最高波數(shù)，這可能歸因于肽鏈之間NH3基團(tuán)較高的相互作用[17]。此外，與SDG相比，HDG和VDG中的酰胺I帶轉(zhuǎn)移到較低的波數(shù)，這意味著長(zhǎng)時(shí)間的熱風(fēng)干燥和真空冷凍干燥破壞了明膠的部分構(gòu)象，形成了更多的分子內(nèi)氫鍵[31]。因此，噴霧干燥可以減少明膠的破壞，較好地保持明膠的結(jié)構(gòu)，與SDS-PAGE的結(jié)果(圖3)保持一致。

表2 不同干燥方式對(duì)明膠FTIR特征基團(tuán)頻率的影響 單位：cm-1

3 結(jié)論

噴霧干燥由于在干燥過(guò)程中干燥室的貼壁行為以及渦旋分離的損失使得明膠得率較低(P<0.05)，而真空冷凍干燥和熱風(fēng)干燥沒(méi)有明顯的差異(P>0.05)。

由于噴霧干燥是一個(gè)快速蒸發(fā)溶劑的過(guò)程，減輕了明膠在干燥過(guò)程中的氧化和降解，增加了明膠的凝膠強(qiáng)度和凝膠持水力。此外，更多的亞基組分可能含有更多的疏水基團(tuán)以及疏水基團(tuán)的暴露使得噴霧干燥的明膠顯示出最大的疏水性，有利于明膠功能性質(zhì)的提高。

紅外結(jié)果表明，噴霧干燥增加了明膠N—H基團(tuán)參與的氫鍵，更有利于明膠在凝膠形成過(guò)程中類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成，賦予明膠更好的凝膠特性，而熱風(fēng)干燥和真空冷凍干燥破壞了明膠的構(gòu)象。因此，噴霧干燥可能更有利于改善明膠的性質(zhì)。