陳敦武，劉翠翠，陳雄，代俊，王志，姚鵑，李沛，李欣*

1(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢，430068)2(安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌，433003)

酵母是乙醇工業(yè)和釀造食品等領(lǐng)域使用最普遍的微生物之一，特別是Saccharomycescerevisiae，因其能在培養(yǎng)基上被完全控制生長等優(yōu)勢而被廣泛研究[1]。然而，S.cerevisiae是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的近800種酵母菌之一，這些物種中的其他幾種可能同樣具有潛在價(jià)值。與S.cerevisiae相比，Pichiakudriavzevii具有更好的耐熱性，40 ℃以上時(shí)仍能表現(xiàn)出良好的生物乙醇發(fā)酵潛力[2-3]。Cyberlindnerafabianii的發(fā)酵性能更多地體現(xiàn)在啤酒釀造過程中芳香物質(zhì)的產(chǎn)生[4]。Candidatropicalis已被用于蘋果醋的發(fā)酵，它可以利用蘋果及其副產(chǎn)品(果皮、果渣等)來生產(chǎn)高濃度的酒精(6.56%vol)[5]。這些酵母在發(fā)酵過程中會面臨諸多環(huán)境壓力，例如溫度的升高會抑制酵母細(xì)胞的正常生長，影響發(fā)酵效率[6-8]；高濃度乙醇會影響細(xì)胞質(zhì)膜的流動性，導(dǎo)致離子平衡的喪失、養(yǎng)分吸收減少和蛋白質(zhì)變性等[9-10]。

發(fā)酵效率和抗逆性之間存在相關(guān)性，而抗逆性往往依賴于抗逆代謝物質(zhì)的積累[11-12]。在壓力條件下，S.cerevisiae在代謝水平上迅速反應(yīng)，合成某些保護(hù)性物質(zhì)，如海藻糖[13-14]。眾多研究表明，S.cerevisiae胞內(nèi)合成的海藻糖在壓力環(huán)境下具有保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的重要功能[15-17]。此外，補(bǔ)加葡萄糖對促進(jìn)S.cerevisiae的生長繁殖非常重要，而且能在一定程度上促進(jìn)海藻糖的合成。據(jù)SUAREZ-MENDEZ等[18]的報(bào)道，進(jìn)入穩(wěn)定期的S.cerevisiae在添加葡萄糖短時(shí)間內(nèi)即可觀察到海藻糖含量的顯著上升。

基于早期的研究[19]，本文分析了4種食品酵母(S.cerevisiae、P.kudriavzevii、C.fabianii、C.tropicalis)在2種不同發(fā)酵過程中(恒速補(bǔ)料耦合恒溫?zé)峒づc變速補(bǔ)料耦合梯度熱激)，面臨葡萄糖和熱激脅迫的生理響應(yīng)，包括細(xì)胞生長、還原糖的消耗、海藻糖和乙醇積累。這項(xiàng)研究的結(jié)果可以為發(fā)酵工廠中酵母菌的篩選和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

P.kudriavzevii、C.fabianii、S.cerevisiae和C.tropicalis由安琪酵母股份有限公司提供。在這項(xiàng)研究中，將所有酵母在YEPD培養(yǎng)基(2%葡萄糖，1%酵母提取物，2%蛋白胨)中30 ℃預(yù)培養(yǎng)24 h，然后接種到優(yōu)化好的糖蜜培養(yǎng)基中[糖蜜38%，酵母粉0.5%，KH2PO41.0%，KCl 0.05%，(NH4)2SO40.5%，MgSO4·7H2O 0.06%]培養(yǎng)。初始接種量OD600保持在0.1。培養(yǎng)基中，除糖蜜為體積分?jǐn)?shù)外，其他成分均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2 基礎(chǔ)發(fā)酵條件

酵母發(fā)酵在20 L機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備工程有限公司)中完成?；景l(fā)酵條件如下：發(fā)酵培養(yǎng)基為12 L；發(fā)酵溫度控制在30 ℃，設(shè)定速度為450 r/min，通氣量為1.3 L/min。使用3 mol/L NaOH和3 mol/L HCl將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值保持在5.0。

1.3 分批發(fā)酵和調(diào)控策略

發(fā)酵溫度的逐步升高會使酵母處在熱激壓力下，往往會觸發(fā)一系列自適應(yīng)反應(yīng)。葡萄糖作為酵母生長代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)，也是海藻糖合成所必需的底物，而且過量的葡萄糖往往導(dǎo)致更加嚴(yán)重的溢流代謝。本研究設(shè)計(jì)了2種不同的葡萄糖流加速率和熱激耦合策略(表1)。策略1，變速進(jìn)料分為2個(gè)階段，包括8～12 h內(nèi)的80 mL/h和12～20 h內(nèi)200 mL/h流加葡萄糖(800 g/L)，并在12～20 h梯度升溫，初始溫度從30 ℃提高到35 ℃，然后溫度每2 h升高2 ℃直到43 ℃。策略2為10～14 h內(nèi)以恒定流速為400 mL/h流加葡萄糖，并在10～16 h內(nèi)溫度控制在35 ℃。

表1 不同的耦合發(fā)酵策略Table 1 Different coupling fermentation strategies

1.4 還原糖、乙醇、生物量和乙醇海藻糖的測定

先將5 mL發(fā)酵液8 000 r/min 10 min離心(2份)。發(fā)酵液中還原糖使用3, 5-二硝基水楊酸法(3, 5-dinitrosalicyic acid, DNS)測定[18]，乙醇含量使用生物傳感器分析儀測定(SBA-90，山東省科學(xué)院生物研究所)。一份濕菌體在80 ℃干燥以評估酵母生物量；另一份濕菌體中加入三氯乙酸(4 mL，0.5 mol/L)抽提1 h，離心(3 000 r/min，5 min，4 ℃)后，在稀釋的上清液(1 mL)中加入5 mL硫酸蒽酮溶液，沸水浴10 min，測量OD630的吸光度用以計(jì)算海藻糖的含量[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母在不同發(fā)酵過程中的增長量

本研究中使用細(xì)胞生物量來評估這4種菌在2種策略條件下的生長趨勢(圖1)。在這2種發(fā)酵調(diào)控策略下，4種酵母的起始生物量為(6.58±0.69)g/L。表2列出了4種酵母在2種策略下非調(diào)控階段的生物量生長(策略1為0～8 h，策略2為0～10 h)。2種情況下，C.tropicalis生物量的增長均最為顯著，分別為21.95 和24.19 g/L。P.kudriavzevii生長最慢，分別為15.78和18.06 g/L。因此，在這種培養(yǎng)條件下，自然生長狀態(tài)下的4個(gè)酵母的生長速率從快到慢依次為C.tropicalis、S.cerevisiae、C.fabianii、P.kudriavzevii。

Pk-P. kudriavzevii；Sc-S. cerevisiae；Cf-C. fabianii；Ct-C. tropicalis a-策略1；b-策略2圖1 兩種策略下的酵母生物量增長Fig.1 Yeast biomass growth under two strategies

表2 非調(diào)控階段的酵母細(xì)胞生物量增長 單位：g/L

在耦合調(diào)控階段，策略1條件下(12～20 h),P.kudriavzevii和S.cerevisiae的生物量持續(xù)增長，至調(diào)控結(jié)束達(dá)到最大值，分別為37.68和35.34 g/L。C.fabianii在整個(gè)階段穩(wěn)定在(30.39±0.82)g/L。C.tropicalis的生長趨勢表現(xiàn)為低壓力(35和37 ℃)增長，嚴(yán)重壓力(>39 ℃)受到輕微抑制，在調(diào)控后期(16～20 h)分別穩(wěn)定在(34.73±1.22)g/L(圖1-a)。策略2條件下(10～14 h)，S.cerevisiae和C.fabianii的生物量增長緩慢，最大值分別為31.27和29.22 g/L。C.tropicalis生物量穩(wěn)定在(32.05±0.47) g/L。P.kudriavzevii的生物量表現(xiàn)為在耦合調(diào)控階段略微上升，增長了6.66 g/L，而在停止補(bǔ)糖后的單獨(dú)控溫階段(14～16 h)生物量下降(圖1-b)。整體上看，P.kudriavzevii和S.cerevisiae的生長幾乎沒有受到梯度熱激的影響，但前者的抗逆生長似乎更加依賴于葡萄糖的流加，而其他2種酵母的生長在一定程度上均受到升溫壓力的抑制。

2.2 酵母在不同發(fā)酵過程中還原糖平均消耗量速率

這4種酵母在2種發(fā)酵策略下非調(diào)控階段的還原糖幾乎消耗完全(數(shù)據(jù)未顯示)，表明所選取的調(diào)控點(diǎn)處于酵母生長的穩(wěn)定期。

在策略1梯度控溫補(bǔ)料階段(表3)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.tropicalis的還原糖平均消耗速率從調(diào)控開始后幾乎維持穩(wěn)定，分別為(13.34±0.21)、(13.06±0.38)和(13.52±0.38)g/(L·h)。C.fabianii的還原糖平均消耗速率先下降后上升，在39 ℃控溫期間降至最小值，為9.16 g/(L·h)，整個(gè)調(diào)控階段的還原糖平均消耗速率為(11.63±1.12)g/(L·h)。在策略2恒溫補(bǔ)料階段(表4)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.tropicalis還原糖平均消耗速率幾乎維持穩(wěn)定，分別為(30.03±0.61)、(30.05±0.83)和(29.27±1.30)g/(L·h)。C.fabianii的還原糖平均消耗速率呈現(xiàn)出先降后升趨勢，在控溫2 h后(11～12 h)降至最低值，為11.23 g/(L·h)，并且整個(gè)調(diào)控階段的還原糖平均消耗速率都表現(xiàn)出較低水平。

表3 策略1條件下酵母細(xì)胞的還原糖平均消耗量速率 單位：g/(L·h)

表4 策略2條件下酵母細(xì)胞的還原糖平均消耗量速率 單位：g/(L·h)

式中：cR，還原糖濃度，g/L；V0，發(fā)酵液體積，L；cS，流加葡萄糖的體積，L；t，時(shí)間點(diǎn)

以上表明不同菌株代謝糖的能力是有差異的，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.tropicalis的還原糖消耗幾乎沒有受到熱激壓力和流加葡萄糖的影響，C.fabianii的還原糖消耗在2種策略下處于較低水平，說明其可能受到了熱激壓力和高濃度葡萄糖的雙重抑制。

2.3 酵母在不同發(fā)酵過程中的海藻糖積累

海藻糖的合成代謝會受到不利環(huán)境的激活，并且其積累水平會根據(jù)生長、養(yǎng)分和壓力條件而發(fā)生顯著變化[22]。在非調(diào)控階段(策略1為0～8 h，策略2為0～10 h)，未觀察到海藻糖合成，此溫度和富含葡萄糖的培養(yǎng)基是酵母生長的理想選擇，可確保細(xì)胞不受壓力。

策略1調(diào)控階段(圖2-a，8～20 h)，4種酵母細(xì)胞均觀察到海藻糖的積累。其中在8～12 h(單獨(dú)補(bǔ)糖階段)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii的胞內(nèi)海藻糖就已經(jīng)開始積累，分別增長了50.99、37.16和7.58 mg/g DCW。然而，C.tropicalis胞內(nèi)海藻糖積累在該階段并沒有受到流加葡萄糖的影響。耦合調(diào)控后，這4種酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖積累呈現(xiàn)出3種不同的趨勢。第一種情形，酵母胞內(nèi)海藻糖積累在耦合階段的前期就幾近完成，其表現(xiàn)為P.kudriavzevii的海藻糖在該階段前2 h 從81.75 mg/g DCW上升到134.35 mg/g DCW，S.cerevisiae的海藻糖在該階段前4 h 從57.77 mg/g DCW上升到115.04 mg/g DCW，2種酵母在整個(gè)發(fā)酵階段的最大海藻糖含量分別為139.62和125.46 mg/g DCW，其中P.kudriavzevii的海藻糖含量經(jīng)過發(fā)酵調(diào)控后增長了3.7倍。第二種情形，C.fabianii的胞內(nèi)海藻糖含量在整個(gè)發(fā)酵階段都表現(xiàn)出平穩(wěn)增長，從10.93 mg/g DCW增長到最大含量91.16 mg/g DCW。第三種情形，低壓力條件下并沒有激發(fā)C.tropicalis海藻糖的合成，而在嚴(yán)重壓力條件下(39 ℃)，其胞內(nèi)海藻糖的積累迅速增加，分別從26.86和27.06 mg/g DCW上升到最大值78.30和92.58 mg/g DCW。隨著調(diào)控策略的結(jié)束，這4種酵母的胞內(nèi)海藻糖含量都呈下降趨勢。

PK-P.kudriavzevii;Sc-S.cerevisaei;Cf-C.fabianii;Ct-C.tropicalis a-策略1；b-策略2圖2 兩種策略下的酵母胞內(nèi)海藻糖含量的變化曲線Fig.2 The change curve of yeast intracellular trehalose content growth under two strategies

策略2調(diào)控階段(圖2-b，10～16 h)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii的海藻糖合成同樣從調(diào)控開始后迅速作出響應(yīng)，尤其是P.kudriavzevii，在耦合調(diào)控階段從25.66 mg/g DCW上升到113.64 mg/g DCW，而在停止補(bǔ)料后，P.kudriavzevii胞內(nèi)海藻糖含量沒有繼續(xù)大量積累，其最大含量在15 h達(dá)到最大值119.19 mg/g DCW。S.cerevisiae和C.fabianii在調(diào)控過程中持續(xù)積累，其海藻糖含量最大值分別為77.05和42.76 mg/g DCW。值得注意的是，在壓力恢復(fù)過程中，酵母細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)海藻糖會迅速降解[23]。在單獨(dú)控溫階段(14～16 h)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii的海藻糖含量并未降低，這表明3種酵母的細(xì)胞內(nèi)海藻糖代謝均對35 ℃熱激有響應(yīng)。然而，C.tropicalis的海藻糖積累并沒有受到耦合調(diào)控的影響。

2.4 酵母在不同發(fā)酵過程中的乙醇含量變化

這些酵母在2種策略條件下的起始乙醇含量為(0.88±0.28)g/L。策略1條件下(圖3-a)，經(jīng)過發(fā)酵調(diào)控后，P.kudriavzevii、S.cerevisiae、C.fabianii和C.tropicalis的乙醇含量分別穩(wěn)定在21.00、19.75和15.56、21.38 g/L左右。在策略2中(圖3-b)，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.tropicalis的乙醇含量持續(xù)積累，最大乙醇含量分別為48(14 h)、38(15 h)、45.5 g/L(14 h)，而停止補(bǔ)料后，這3種酵母的乙醇含量并沒有呈現(xiàn)出持續(xù)增長趨勢。C.fabianii的乙醇含量在耦合發(fā)酵調(diào)控前期(10～12 h)略微增長，后期穩(wěn)定在13.00 g/L左右，整體上表現(xiàn)出較低的乙醇發(fā)酵水平?？傮w而言，高速流加的葡萄糖有利于P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.tropicalis積累乙醇，而C.fabianii的乙醇含量增長緩慢很可能源自于其還原糖消耗受到了抑制。根據(jù)此前的報(bào)道，在優(yōu)化好的培養(yǎng)體系下，利用P.kudriavzevii進(jìn)行高溫乙醇發(fā)酵(40 ℃)時(shí)，乙醇含量能達(dá)到(88.60±0.75)g/L，明顯高于釀酒酵母[24]。可見，P.kudriavzevii有著更強(qiáng)的高溫乙醇發(fā)酵潛力。

PK-P.kudriavzevii;Sc-S.cerevisaei;Cf-C.fabianii;Ct-C.tropicalis a-策略1；b-策略2圖3 酵母在不同發(fā)酵過程中的乙醇含量變化Fig.3 The changes of ethanol content of yeast during different fermentation

3 討論

本研究比較了P.kudriavzevii、S.cerevisiae、C.fabianii和C.tropicalis對葡萄糖的流加強(qiáng)度和熱激壓力的生理響應(yīng)，結(jié)果表明這些酵母在2種調(diào)控策略下的細(xì)胞內(nèi)海藻糖的積累差異最明顯，下面將主要圍繞海藻糖進(jìn)行討論。

目前研究酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖的積累往往使用短時(shí)壓力來處理酵母細(xì)胞，它只能反映細(xì)胞的瞬時(shí)反應(yīng)特征，例如在乙醇作為碳源的培養(yǎng)基中，野生型S.cerevisiae(W303-1A)的胞內(nèi)海藻糖水平在90 min內(nèi)增加至基礎(chǔ)水平(未添加脅迫條件)的2倍[25]。MAGALHES等[26]將S.cerevisiae(BY4741)的培養(yǎng)溫度從 28 ℃升至40 ℃后，觀察到其胞內(nèi)海藻糖水平在1 h內(nèi)增長顯著。然而，關(guān)于長時(shí)間壓力脅迫下的酵母細(xì)胞生理特性的研究相對較少。

如圖2所示，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii的胞內(nèi)海藻糖在流加葡萄糖后積累，尤其是P.kudriavzevii，增長了3.4倍，而熱帶假絲酵母幾乎無變化。葡萄糖不僅可以作為分子信號促進(jìn)糖酵解途徑，還可能會使酵母細(xì)胞進(jìn)入不平衡狀態(tài)，激活其應(yīng)激代謝途徑[27]。這種對于葡萄糖流加的不同響應(yīng)很可能源于酵母細(xì)胞內(nèi)的6-磷酸海藻糖合酶(trehalose-6-phosphate synthase gene，TPS1)和糖原合成酶對二磷酸尿苷葡萄糖(海藻糖和糖原合成的共前體物)的利用率存在著差異[28]。在梯度升溫條件下，所有酵母的乙醇含量都維持穩(wěn)定(圖3)，而海藻糖含量均呈現(xiàn)出上升趨勢(圖2-a)。研究表明，S.cerevisiae的TPS1具有強(qiáng)烈的溫度依賴性[29-30]。當(dāng)壓力環(huán)境觸發(fā)酵母細(xì)胞的應(yīng)激代謝反應(yīng)后，更多的碳被導(dǎo)向糖異生并進(jìn)入糖酵解途徑的上部，流向海藻糖合成途徑[31]。值得注意的是，P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii在低壓力(35、37 ℃)即可誘導(dǎo)胞內(nèi)海藻糖的合成，而C.tropicalis直到嚴(yán)重壓力(>39 ℃)才開始海藻糖的積累。這暗示著C.tropicalis海藻糖合成的激活溫度較P.kudriavzevii、S.cerevisiae和C.fabianii更高。