王巧莉，孔梓璇，譚強飛，贠建民，張紊瑋，趙風(fēng)云

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州, 730070)

草菇(Volvariellavolvacea)，又名稻草菇，是世界第三大栽培的食用菌。其肉質(zhì)鮮嫩、香味濃郁，有較高的營養(yǎng)價值和醫(yī)用價值[1-2]，是熱帶和亞熱帶地區(qū)廣受歡迎的栽培蘑菇之一[3]。目前，草菇從傳統(tǒng)的小農(nóng)種植逐漸轉(zhuǎn)向工廠化生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，我國草菇年產(chǎn)量約為33萬t，占全球產(chǎn)量的80%[4]。同其他食用菌一樣，菌種退化是限制草菇生產(chǎn)和發(fā)展的重要因素。草菇是典型的高溫型食用菌，不耐低溫貯藏的特性，使其退化現(xiàn)象尤為嚴(yán)重。

草菇的栽培原料一般為天然植物纖維，如稻草、棉籽殼等，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等[5]。這些大分子高聚物必須在相應(yīng)的降解酶作用下轉(zhuǎn)化為低分子化合物才能被菌絲吸收利用，以維持菌絲生長及提供出菇的能量，因此草菇的生物學(xué)效率與其產(chǎn)生的降解酶活性有較大的關(guān)聯(lián)性[6]。草菇在生長過程中，產(chǎn)生的外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶共同作用分解纖維素，產(chǎn)生漆酶、錳過氧化物酶等分解木質(zhì)素[7]，產(chǎn)生木聚糖酶等以分解半纖維素[8]。

組織分離是指從食用菌子實體組織中分離純菌絲體進行繁殖的方法，常用于食用菌菌種提純和復(fù)壯。胡中娥等[9]通過組織分離技術(shù)提高了北冬蟲夏草菌種的菌絲活力和生物學(xué)效率。趙風(fēng)云等[10]利用單孢分離結(jié)合組織分離技術(shù)獲得了草菇高產(chǎn)菌株。但草菇連續(xù)多次組織分離是否會引起菌種退化，致其退化的機制是什么，目前尚未見系統(tǒng)報道。

本文利用連續(xù)組織分離方法獲得了18代草菇繼代菌株，測定分析各菌株的基質(zhì)降解相關(guān)酶活力，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)探討草菇組織分離繼代過程中的退化現(xiàn)象及相關(guān)酶活力變化，以期為草菇菌種退化鑒定及退化機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

原種(T0)：草菇菌株V844保藏于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。

繼代菌種(T1～T18)：將T0進行栽培試驗獲得子實體，并經(jīng)組織分離得到T1，將T1進行栽培，得子實體進行組織分離得T2，以此方法得到18株組織分離繼代菌株T1～T18。

草菇原種T0和繼代菌種T1～T18均于20 ℃恒溫保存于液體石蠟中。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO41.0 g，MgSO41.0 g，瓊脂粉 2 g，去離子水1 000 mL，pH 自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：粉碎的棉籽殼10 g，酵母抽提物5 g，KH2PO40.6 g，MgSO40.5 g，去離子水1 000 mL，pH 自然。

1.2 實驗方法

1.2.1 草菇生理性狀測定

氣生菌絲密度：將T0～T18共19個菌株統(tǒng)一活化后，放置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d后觀察并記錄氣生菌絲密度。

菌絲生長速度(mm/h)：參照安學(xué)明等[11]方法測定。

菌絲生物質(zhì)量(g)：將統(tǒng)一活化好的菌株用直徑6 mm的打孔器接種1個菌絲塊于新鮮PDA平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，然后輕輕刮下菌絲體，用分析天平稱量，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 相關(guān)酶活力的測定

粗酶液的制備：將統(tǒng)一活化好的菌株用直徑6 mm的打孔器接種3個菌絲塊于液體培養(yǎng)基中。在33 ℃，200 r/min搖床中培養(yǎng)8 d，定期取發(fā)酵液。將發(fā)酵液在4 ℃，11 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液即為粗酶液。

外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、濾紙酶和半纖維素酶活力測定均采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法[12]；漆酶活力測定采用ABTS法[13]；錳過氧化物酶活力測定參照崔堂武等[14]的方法；木聚糖酶活力測定參考王曉丹等[15]的方法。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

將T0、T4、T8、T12和T16共5個菌株在PDA平板上統(tǒng)一培養(yǎng)3 d，收集菌絲體放入滅酶冷凍管中，迅速放入液氮中冷凍，并送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灐?/p>

參照楊新等[16]的方法從轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中篩選出與基質(zhì)降解相關(guān)酶的差異表達(dá)基因，并對這些數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個菌株的所有指標(biāo)測定均設(shè)3組重復(fù)，采用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，采用Origin 9.0和Heatmap軟件作圖，用Spss 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織分離繼代對草菇生理性狀的影響

2.1.1 氣生菌絲密度的變化

將T0～T18在PDA平板上統(tǒng)一培養(yǎng)，第3天觀察并記錄氣生菌絲密度，結(jié)果如圖1所示。T0～T11氣生菌絲密度變化不明顯。從T12開始，隨著繼代次數(shù)增加，氣生菌絲密度開始降低，菌落直徑逐漸減少，菌株呈現(xiàn)退化趨勢。

圖1 草菇氣生菌絲密度的變化Fig.1 Changes of mycelial density of Volvariella volvacea注：培養(yǎng)基直徑90 mm

2.1.2 菌絲生長速度和菌絲生物質(zhì)量的變化

由圖2可知，隨著繼代次數(shù)的增加，菌絲生長速度和菌絲生物質(zhì)量均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，菌絲生長速度與菌絲生物質(zhì)量之間呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)。菌絲生長速度在T8達(dá)到峰值，而后下降，T12以后下降趨勢明顯加快，T18的菌絲生長速度較T0降低了14.7%。菌絲生物質(zhì)量在T4達(dá)到峰值，而后下降，菌株T12～T18的生物質(zhì)量均顯著

圖2 草菇菌絲生長速度和菌絲生物質(zhì)量的變化Fig.2 Changes of mycelial growth rate and mycelial biological quality in Volvariella volvacea

2.2 組織分離繼代對基質(zhì)降解酶活力的影響

2.2.1 纖維素降解相關(guān)酶活力的變化

纖維素降解相關(guān)酶活力變化如圖3所示。外切葡聚糖酶呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在T4時達(dá)到了峰值，T18的酶活力較T0降低了34.2%(圖3-a)。內(nèi)切葡聚糖酶活力從T0到T6差異不顯著(P>0.05)，從T7開始，隨著繼代次數(shù)的增加，呈現(xiàn)下降趨勢，T12以后下降趨勢加快，T18的酶活力較T0降低了66.7%(圖3-b)。β-葡萄糖苷酶活力變化差異不顯著(P>0.05)(圖3-c)。濾紙酶活力從T0到T4差異不顯著(P>0.05)，從T5開始，隨著繼代次數(shù)的增加，呈現(xiàn)下降趨勢，T18的酶活力較T0降低了86.4%(圖3-d)。

a-外切葡聚糖酶；b-內(nèi)切葡聚糖酶；c-β-葡萄糖苷酶；d-濾紙酶圖3 纖維素降解相關(guān)酶活力的變化Fig.3 Changes in cellulose degradation-related enzymes activity注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.2 木質(zhì)素降解相關(guān)酶活力的變化

木質(zhì)素降解相關(guān)酶活力的變化如圖4所示。漆酶和錳過氧化物酶活力均呈先上升后下降趨勢。漆酶活力從T0到T4逐漸增高，在T4達(dá)到峰值，而后逐漸下降，T18的酶活力較T0降低了71.1%(圖4-a)。錳過氧化物酶活力在T5達(dá)到峰值，而后逐漸下降，T18的酶活力較T0降低了90.0%(圖4-b)。

a-漆酶；b-錳過氧化物酶圖4 木質(zhì)素降解相關(guān)酶活力的變化Fig.4 Changes in lignin degradation-related enzymes activity

2.2.3 半纖維素降解相關(guān)酶活力的變化

半纖維素降解相關(guān)酶活力的變化如圖5所示。木聚糖酶活力從T0到T4差異不顯著(P>0.05)，從T5開始，隨著繼代次數(shù)的增加，呈現(xiàn)下降趨勢，T18的酶活力較T0降低了67.9%(圖5-a)。半纖維素酶活力呈先上升后下降趨勢，在T8達(dá)到峰值后逐漸下降，T18的酶活力較T0降低了58.7%(圖5-b)。

2.2.4 相關(guān)酶的差異表達(dá)基因分析

分析轉(zhuǎn)錄學(xué)組數(shù)據(jù)，篩選出34個與基質(zhì)降解相關(guān)的差異表達(dá)基因。由圖6可知，外切葡聚糖酶(jgi|Volvo1|118037)、β-葡萄糖苷酶(jgi|Volvo1|120086)基因先上調(diào)后下調(diào)；內(nèi)切葡聚糖酶(jgi|Volvo1|115063、jgi|Volvo1|114279)、木聚糖酶(jgi|Volvo1|120751、jgi|Volvo1|121659)基因下調(diào)；漆酶家族的jgi|Volvo1|115448、jgi|Volvo1|115483下調(diào)，jgi|Volvo1|115484、jgi|Volvo1|115506上調(diào)，jgi|Volvo1|115476先上調(diào)后下調(diào)；錳過氧化酶家族的jgi|Volvo1|114735、jgi|Volvo1|113255、jgi|Volvo1|115023下調(diào)，jgi|Volvo1|116037上調(diào)。其余19個(8個下調(diào)，5個上調(diào)，6個先上調(diào)后下調(diào))均為碳水化合物家族相關(guān)基因，間接參與草菇基質(zhì)降解。

a-木聚糖酶；b-半纖維素酶圖5 半纖維素降解相關(guān)酶活力的變化Fig.5 Changes in hemicellulose degradation-related enzymes activity

圖6 基質(zhì)降解相關(guān)差異表達(dá)基因的表達(dá)量變化Fig.6 Changes of differentially expressed genes related to substrate degradation

3 討論與結(jié)論

根據(jù)營養(yǎng)源不同，可將食用菌分為木腐菌和草腐菌。草菇屬于典型的草腐菌，以稻草、麥稈、廢棉、棉籽殼等為生長基質(zhì)，這些基質(zhì)中均含有大量的纖維素、半纖維素及部分木質(zhì)素，為草菇的生長發(fā)育提供碳源等營養(yǎng)物質(zhì)[17]。在生長過程中，草菇菌絲首先在纖維素的末端開始分解；再從端部進入基質(zhì)內(nèi)部，由內(nèi)向外分泌纖維素酶(外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等)和半纖維素酶(木聚糖酶等)，使其共同作用降解基質(zhì)[18-20]。漆酶、錳過氧化酶可以破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，使較多的纖維素分子裸露出來，由纖維素酶將基質(zhì)大分子降解為單分子葡萄糖[21]。測定基質(zhì)降解相關(guān)酶活力可以在一定程度上反映出草菇對基質(zhì)的利用效率。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門在整體上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，是在mRNA水平上研究基因的表達(dá)情況[22]。本文通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶有關(guān)的差異表達(dá)基因34個，主要差異表達(dá)基因如外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和部分漆酶基因隨著繼代次數(shù)的增加先上調(diào)后下調(diào)；內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和部分錳過氧化酶基因下調(diào)?；|(zhì)降解相關(guān)酶活力測定表明，隨著繼代次數(shù)的增加，外切葡聚糖酶、半纖維素酶、漆酶和錳過氧化物酶活力先增加后下降，木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和濾紙酶呈下降趨勢。生理性狀指標(biāo)檢測表明，氣生菌絲密度和菌落直徑隨繼代次數(shù)的增加逐漸降低，菌絲生長速度和菌絲生物量先增加后下降。綜上可知，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、相關(guān)酶活及生理性狀在連續(xù)繼代過程中的變化趨勢基本一致。初步推測，在草菇連續(xù)組織分離繼代過程中，mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)導(dǎo)致蛋白表達(dá)即相關(guān)酶活力的變化，最終影響了草菇表觀性狀如氣生菌絲密度、菌絲生長速度等指標(biāo)的改變。

綜合分析草菇組織分離繼代菌株的生理性狀、相關(guān)酶活及轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)連續(xù)組織分離繼代4次時，草菇菌種有明顯地復(fù)壯效果，但當(dāng)連續(xù)繼代12次以上時，組織分離繼代會導(dǎo)致菌種出現(xiàn)退化現(xiàn)象。