章 慧,豐東升,張唯誼,陳美蓮,王藝嬌

(上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(上海),上海201708)

農(nóng)藥是把雙刃劍,在提高農(nóng)作物產(chǎn)量保證人類食物供給方面做出了巨大的貢獻(xiàn),但若使用不當(dāng),農(nóng)藥殘留問(wèn)題會(huì)嚴(yán)重危害廣大人民群眾的身體健康。 在合作社加農(nóng)戶的種植方式下,施肥用藥難以監(jiān)管,特別是葉菜類蔬菜,流通領(lǐng)域停留時(shí)間極短,若不經(jīng)農(nóng)藥殘留檢測(cè)就進(jìn)行銷售,極易導(dǎo)致食品安全事故。 因此,利用農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)產(chǎn)地輸出及外地流入當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)的蔬菜實(shí)施全面監(jiān)控,實(shí)現(xiàn)安全監(jiān)控“全覆蓋”意義重大。

目前,廣泛應(yīng)用的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法為酶抑制率法,受酶特異性的影響,該方法主要用于檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯兩類農(nóng)藥[1],但該方法易受酶試劑和酶活力的影響,檢測(cè)結(jié)果可信度較低[2]。 膠體金免疫層析技術(shù)是20 世紀(jì)末發(fā)展起來(lái)的一種固相標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)[3],具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、無(wú)污染、成本低等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、食品安全及動(dòng)物疫病診斷等領(lǐng)域[4]。 但目前應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測(cè)蔬菜農(nóng)藥殘留的試紙種類較少,制約了該檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步推廣[5]。

噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺均為《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)[6]在蔬菜產(chǎn)品中有限量規(guī)定的農(nóng)藥品種,本項(xiàng)目對(duì)膠體金法快速檢測(cè)蔬菜中噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺的技術(shù)開(kāi)展應(yīng)用研究,旨在為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管和農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)者安全自檢工作提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機(jī)在市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)結(jié)球甘藍(lán)、辣椒、黃瓜、番茄、芹菜、西葫蘆、苦苣、紅米莧、韭菜、大蒜、菜薹、結(jié)球萵苣、生菜、洋蔥、蔥、菜豆、胡蘿卜、馬鈴薯各3 份,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確認(rèn)噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺檢出為陰性后,再用膠體金快速試紙條驗(yàn)證。 噠螨靈快速檢測(cè)試紙條(YRSPN1028)、咪鮮胺快速檢測(cè)試紙條(YRSPN1025)、嘧霉胺快速檢測(cè)試紙條(YRSPN1017)購(gòu)自深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司;噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

膠體金法讀數(shù)儀YR-100,深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司;液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS),沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 膠體金法

原理:在檢測(cè)微孔中凍干金標(biāo)抗體,在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線(T 線)和對(duì)照線(C 線)處分別包被噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺抗原和羊抗鼠IgG 二抗。 樣本中若含有噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺,則在微孔溫育過(guò)程中與膠體金標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合,從而抑制金標(biāo)抗體與硝酸纖維素膜上包被的噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺抗原的結(jié)合。

前處理:每種蔬菜樣品稱取(2 ±0.1)g,剪碎或攪碎后分別加入到15 mL 或50 mL 離心管中;加入8 mL YRSPN 樣品通用提取液,充分震蕩混勻,即為待測(cè)液。 重復(fù)3 次。

檢測(cè):從配套的檢測(cè)試劑盒里取出紅色微孔試劑,依次加入200 μL 待測(cè)液,用一次性吸管上下抽吸混勻后反應(yīng)3 min(20—40 ℃)。 取出試紙條,將其插入上述紅色微孔中,反應(yīng)6 min(20—40 ℃)。 從微孔中取出試紙條,輕輕刮去其下端的吸水海綿,并進(jìn)行結(jié)果判讀。 若T 線顏色較C 線顏色深,則結(jié)果為陰性(未檢出);若T 線顏色較C 線顏色淺,或T 線不顯色,則結(jié)果為陽(yáng)性(檢出);若T 線、C 線均不顯色則檢出結(jié)果無(wú)效。

1.3.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法

噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺的檢測(cè)按照《水果和蔬菜中450 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB∕T 20769—2008)[7]規(guī)定的方法進(jìn)行。

1.4 靈敏度試驗(yàn)

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)[6]中對(duì)噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺在蔬菜中的殘留量均有規(guī)定。 本試驗(yàn)針對(duì)三種農(nóng)藥在各類蔬菜中的限量標(biāo)準(zhǔn),每種蔬菜均設(shè)置4 個(gè)加標(biāo)濃度,即本底濃度(空白)、1∕2 限量值濃度或產(chǎn)品標(biāo)識(shí)檢出限濃度(如產(chǎn)品檢出限即為該藥物在某種蔬菜上的限量值即設(shè)定1∕2 限量值濃度,如產(chǎn)品檢出限低于該藥物在某種蔬菜上的限量值則設(shè)定產(chǎn)品標(biāo)識(shí)檢出限濃度)、限量值濃度和2 倍限量值濃度。 除標(biāo)準(zhǔn)中明確限量的蔬菜品種外,另選幾種市面上常見(jiàn)的蔬菜作為驗(yàn)證樣品開(kāi)展靈敏度試驗(yàn)。 每份試驗(yàn)樣品均做3 個(gè)重復(fù)。 每種農(nóng)藥各選定9 種蔬菜做為靈敏度試驗(yàn)樣品。

1.5 實(shí)物陽(yáng)性樣品驗(yàn)證試驗(yàn)

選擇生產(chǎn)過(guò)程中未施用過(guò)農(nóng)藥的生菜,對(duì)其噴灑主要藥效成分為噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的農(nóng)藥品種,噴灑3 d 后采摘,將其運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室,先用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)樣品中農(nóng)藥殘留的含量進(jìn)行測(cè)定,再將樣品稀釋到產(chǎn)品最低檢出限的0.5 倍、1 倍、2 倍水平。 噴灑了不同農(nóng)藥的基質(zhì)均做3 個(gè)平行,每個(gè)檢出水平做10 個(gè)平行。

1.6 交叉反應(yīng)測(cè)試

噠螨靈、咪鮮胺沒(méi)有結(jié)構(gòu)類似物,嘧霉胺的結(jié)構(gòu)類似物為嘧菌環(huán)胺,因此選擇嘧菌環(huán)胺、克百威、毒死蜱、多菌靈、啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉、甲氰菊脂、溴氰菊酯、百菌清、腐霉利共10 種農(nóng)藥開(kāi)展交叉反應(yīng)測(cè)試。 將克百威、毒死蜱、多菌靈、啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉、甲氰菊脂、溴氰菊酯、百菌清、腐霉利這9 種農(nóng)藥配制成為濃度均為20 μg∕mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。 再將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋到2.00 mg∕kg、1.00 mg∕kg、0.50 mg∕kg,待用。 用噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺膠體金試紙條分別測(cè)試不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,觀察是否有交叉反應(yīng)。 另將嘧菌環(huán)胺配置成0.50 mg∕kg 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用嘧霉胺膠體金試紙條進(jìn)行測(cè)試,觀察是否有交叉反應(yīng)。

1.7 結(jié)果評(píng)價(jià)

按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局制定的《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》,評(píng)價(jià)膠體金方法的靈敏度、特異性、假陽(yáng)∕陰性率及與參比方法的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)的靈敏度

由表1—3 可知,不同蔬菜基質(zhì)中噠螨靈的檢出限均能達(dá)到2.0 mg∕kg,咪鮮胺的檢出限均能達(dá)到1.0 mg∕kg,嘧霉胺的檢出限能達(dá)到0.05 mg∕kg,3 種農(nóng)藥驗(yàn)證的檢出限均能達(dá)到與膠體金試劑條說(shuō)明書(shū)中描述的最低水平。

表1 噠螨靈的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 1 Sensitivity test results of pyridaben

2.2 實(shí)驗(yàn)室加標(biāo)假陽(yáng)性率

隨機(jī)在市場(chǎng)上抽取9 種蔬菜各3 份,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確認(rèn)為陰性后再用膠體金快速試紙條進(jìn)行檢測(cè)以驗(yàn)證其假陽(yáng)性率,結(jié)果見(jiàn)表4,噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的假陽(yáng)性率均為0%。

2.3 實(shí)驗(yàn)室加標(biāo)假陰性率

準(zhǔn)確稱取噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解,均配置成濃度為100 μg∕mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,再將標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到已確認(rèn)為陰性的蔬菜樣品中,使其在蔬菜樣品中的終濃度分別為2.00 mg∕kg、1.00 mg∕kg、0.50 mg∕kg,然后用膠體金試紙條進(jìn)行加標(biāo)驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)表5。 噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的假陰性率均為0%。

表2 咪鮮胺的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 2 Sensitivity test results of prochloraz

表3 嘧霉胺的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 3 Sensitivity test results of pyrimethanil

2.4 實(shí)物陽(yáng)性樣品

如表6 所示,實(shí)物陽(yáng)性樣品驗(yàn)證噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺殘留的假陽(yáng)性率均為0%,噠螨靈和嘧霉胺假陰性率均為0%,僅咪鮮胺在1 mg∕kg 測(cè)試濃度下有1 例出現(xiàn)假陰性,膠體金法檢測(cè)3 種農(nóng)藥殘留與參比方法相比均無(wú)顯著性差異(χ2＜3.84)。

2.5 交叉反應(yīng)測(cè)試

用100 根噠螨靈膠體金試紙條測(cè)試1.6 中配置的2.00 mg∕kg 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)果均為陰性;用100 根咪鮮胺膠體金試紙條測(cè)試1.6 中配置的1.00 mg∕kg 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)果均為陰性;用100 根嘧霉胺膠體金試紙條1.6 中配置的0.05 mg∕kg 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)果均為陰性。 用100 根嘧霉胺膠體金試紙條進(jìn)行測(cè)試0.50 mg∕kg 的嘧菌環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)果有12 根試紙條顯示陽(yáng)性,交叉反應(yīng)率為12%。

表4 噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的假陽(yáng)性率(n=3)Table 4 The false positive rate of pyridaben,prochloraz,pyrimethanil

表5 噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的假陰性率(n=3)Table 5 The false negative rate of pyridaben,prochloraz,pyrimethanil

表6 噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的實(shí)物陽(yáng)性樣品的驗(yàn)證結(jié)果Table 6 The verification results of physical positive samples of pyridaben,prochloraz,pyrimethanil

3 結(jié)論與討論

目前,噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的檢測(cè)多采用氣相色譜或液相色譜法[8-10],該類方法不僅操作復(fù)雜,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),還必須在固定的實(shí)驗(yàn)室中操作,無(wú)法滿足基層農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管的需要。 本研究表明,膠體金法快速檢測(cè)蔬菜中噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的殘留,其檢測(cè)結(jié)果與液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果相比無(wú)顯著性差異,且更為簡(jiǎn)便、快速,15 分鐘內(nèi)即可完成一件樣品從前處理到讀取結(jié)果的全部檢測(cè)工作。另外,該方法的靈敏度較高,基本能滿足一般基質(zhì)中噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的檢測(cè)限量要求,但是,《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)[6]中規(guī)定黃瓜中噠螨靈的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為0.1 mg∕kg,而膠體金產(chǎn)品的檢出限僅能達(dá)到2.0 mg∕kg;大蒜中咪鮮胺的殘留限量值為0.1 mg∕kg,而產(chǎn)品檢出限僅能達(dá)到1.0 mg∕kg,這會(huì)導(dǎo)致實(shí)際應(yīng)用中部分陽(yáng)性樣品的漏檢。 另外,《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)[6]中規(guī)定薹和辣椒中咪鮮胺的殘留限量值為2.0 mg∕kg,而該產(chǎn)品檢出限為1.0 mg∕kg;除馬鈴薯中嘧霉胺的殘留限量值與產(chǎn)品檢出限相同,為0.05 mg∕kg 外,其他蔬菜的限量值均大于該檢出限,這會(huì)造成檢出結(jié)果假陽(yáng)性率偏高,而檢出的陽(yáng)性樣品往往需要送到專業(yè)的第三方實(shí)驗(yàn)室用儀器方法進(jìn)行確認(rèn),容易耽誤產(chǎn)品上市時(shí)間,失去快速檢測(cè)的意義。 因此建議針對(duì)限量值不同的蔬菜開(kāi)發(fā)針對(duì)性的檢測(cè)產(chǎn)品,產(chǎn)品的檢出限不能過(guò)高或過(guò)低,檢出限達(dá)到限量值的水平即可,這樣更利于基層監(jiān)測(cè)人員第一時(shí)間判斷檢測(cè)結(jié)果。

膠體金快速檢測(cè)法操作簡(jiǎn)便,且靈敏度高,檢測(cè)人員只需稍加培訓(xùn)即可進(jìn)行檢測(cè)操作,適于基層人員開(kāi)展蔬菜中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)。 但該方法目前能檢測(cè)的農(nóng)藥品種不多,與實(shí)際生產(chǎn)的需求還有一定差距,市場(chǎng)上經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)驗(yàn)證的產(chǎn)品也很少,需要進(jìn)一步提高該類產(chǎn)品在生產(chǎn)和基層一線的適用性以滿足當(dāng)前我國(guó)蔬菜生存和監(jiān)管的實(shí)際需求,實(shí)現(xiàn)源頭監(jiān)管的理念。