王 璨，王保和，黃宇虹，李自強(qiáng)，張 涵

UPLC-MS/MS同時(shí)測定大鼠血漿中熱毒寧注射液13個(gè)潛在質(zhì)量標(biāo)志物及其藥動(dòng)學(xué)研究

王 璨1，王保和2*，黃宇虹2，李自強(qiáng)2*，張 涵1

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617 2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250

基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）概念，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法建立同時(shí)測定血漿中熱毒寧注射液13個(gè)潛在Q-Marker含量的方法，并用于大鼠體內(nèi)血藥濃度測定及藥動(dòng)學(xué)研究，以證明其體外-體內(nèi)傳遞過程的可測性。采用Waters AQUITY UPLC C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脫，體積流量0.3 mL/min；柱溫為35 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。以氯霉素為內(nèi)標(biāo)，采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子源，多反應(yīng)離子檢測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，同時(shí)定量血漿中13個(gè)Q-Marker（梔子苷、京尼平苷酸、京尼平龍膽雙糖苷、山梔苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、4,5-二--咖啡酰奎寧酸、裂環(huán)氧化馬錢子苷、裂環(huán)馬錢子酸、獐牙菜苷）含量。采用Phoenix WinNonlin8.1軟件非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。13個(gè)化合物在檢測范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定，該方法回收率、基質(zhì)效應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性均符合生物樣品的測定要求。尾iv熱毒寧注射液后在大鼠血漿中可檢測到上述13個(gè)化合物，裂環(huán)馬錢子酸在血漿中暴露量最大，梔子苷和綠原酸次之。各化合物在體內(nèi)半衰期較短，消除速率快；表觀分布容積提示所有化合物呈廣泛組織分布。該方法可以同時(shí)定量血漿中熱毒寧注射液的13個(gè)成分，證明了上述成分體外-體內(nèi)傳遞過程的可測性；藥動(dòng)學(xué)研究表明上述成分還具有血漿-組織/靶器官傳遞性，可作為熱毒寧注射液安全性和有效性評(píng)價(jià)的潛在Q-Marker。

質(zhì)量標(biāo)志物；熱毒寧注射液；UPLC-MS/MS；藥動(dòng)學(xué)；梔子苷；京尼平苷酸；京尼平龍膽雙糖苷；山梔苷；綠原酸；新綠原酸；隱綠原酸；異綠原酸A；異綠原酸B；4,5-二--咖啡?？鼘幩?；裂環(huán)氧化馬錢子苷；裂環(huán)馬錢子酸；獐牙菜苷

中藥注射液的質(zhì)量保障是臨床用藥療效及其安全性的根本，其化學(xué)成分復(fù)雜，僅對(duì)化合物濃度單一指標(biāo)進(jìn)行中藥注射劑質(zhì)量控制的體系尚不完善。隨著中藥代謝動(dòng)力學(xué)的研究發(fā)展，形成了“基于體內(nèi)過程的中藥有效成分和有效效應(yīng)物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)策略”[1-2]。近年來，劉昌孝院士[3-4]提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）概念，將注射劑中固有的、與其功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)作為反映該注射劑有效性和安全性的標(biāo)示性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)控，為中藥注射劑質(zhì)量控制體系提供了新思路。

熱毒寧注射液是由金銀花、梔子和青蒿組方制成的復(fù)方制劑，具有清熱、疏風(fēng)、解毒之功效，臨床上廣泛用于治療以高熱畏寒、頭身痛、咳嗽咳痰為主癥的急性上呼吸道感染[5–10]，還被用于治療及輔助治療手足口病[11–13]、病毒性腸炎[14-15]、新型冠狀病毒肺炎[16]、社區(qū)獲得性肺炎[17]、支原體肺炎[18]、慢性阻塞性肺疾病[19]等。每毫升注射液由0.6 g梔子、0.75 g金銀花和1.25 g青蒿提取制備而成[20]，主要活性成分為環(huán)烯醚萜類和有機(jī)酚酸類化合物。Cheng等[20]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法鑒定出熱毒寧注射液中含有19個(gè)環(huán)烯醚萜類（0.01～27.93 mmol/L）、16個(gè)有機(jī)酸類（0.04～19.06 mmol/L）和11個(gè)黃酮類（＜0.08 mmol/L）化合物，并測定了其中11個(gè)成分在大鼠體內(nèi)的血藥濃度；吳莎等[21]應(yīng)用UPLC測定熱毒寧注射液中11個(gè)成分含量，并繪制指紋圖譜；Wang等[22-23]采用UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)大鼠血漿中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、京尼平苷及3個(gè)二咖啡?？鼘幩岱謩e進(jìn)行含量測定。崔小弟等[24]建立一測多評(píng)法（quantitative analysis multi- components by single marker，QAMS），以綠原酸和梔子苷為參照物，同時(shí)測定熱毒寧注射液中有機(jī)酸類和環(huán)烯醚萜苷類共9個(gè)活性成分。

基于Q-Marker篩選的“五原則”[25]，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[26-28]及指紋圖譜測定[21,29]認(rèn)為熱毒寧注射液中梔子苷（geniposide，GP）、京尼平苷酸（geniposidic acid，GPA）、京尼平龍膽雙糖苷（genipin-1-β-- gentiobioside，GPGS）、山梔苷（shanzhiside，SZS）、綠原酸（chlorogenic acid，CGA）、新綠原酸（neochlorogenic acid，NCGA）、隱綠原酸（cryptochlorogenic acid，CCGA）、異綠原酸A（isochlorogenic acid A，ICGAa）、異綠原酸B（isochlorogenic acid B，ICGAb）、4, 5-二--咖啡酰奎寧酸（4, 5-dicaffeoylquinic acid，ICGAc）、裂環(huán)氧化馬錢子苷（secoxyloganin，SL）、裂環(huán)馬錢子酸（secologanic acid，SLA）、獐牙菜苷（sweroside，SWS）與其抗炎、抗氧化、抗菌作用相關(guān)，且與梔子[30]和金銀花[29]的預(yù)測Q-Marker重合，可成為熱毒寧注射液潛在的Q-Marker。前期研究中尚無同時(shí)測定上述13種化合物（圖1）的方法，為進(jìn)一步對(duì)熱毒寧注射液的Q-Marker進(jìn)行深入探索，本研究采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立同時(shí)測定大鼠血漿中上述13種化合物定量分析方法，并以尾iv熱毒寧在大鼠血漿中的藥動(dòng)學(xué)研究驗(yàn)證潛在Q-marker在其體外-體內(nèi)傳遞過程的可測性。

圖1 熱毒寧注射液13個(gè)潛在Q-Marker

1 材料與儀器

1.1 試劑及藥品

對(duì)照品GP（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.1%，批號(hào)110749- 201919）、GPA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.1%，批號(hào)111828- 201805）、CGA（96.8%，批號(hào)110753-201817）、SWS（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.1%，批號(hào)111742-200501）購于中國食品藥品檢定研究院；對(duì)照品GPGS（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，批號(hào)7382）、NCGA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，批號(hào)7864）、CCGA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，批號(hào)3208）、ICGAa（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，批號(hào)7867）、ICGAb（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，批號(hào)3089）、ICGAc（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，批號(hào)3001）、SLA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，批號(hào)6719）購于上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；對(duì)照品SZS（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%，批號(hào)P30J9F64637）購自上海源葉生物科技有限公司；SL（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)19050905）購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；內(nèi)標(biāo)物（IS）采用氯霉素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，批號(hào)56757）購自TRC公司；色譜級(jí)乙腈和甲醇購自美國Fisher公司，色譜純甲酸購自美國TEDIA公司，分析純-(＋)-抗壞血酸（批號(hào)20200526）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。熱毒寧注射液（批號(hào)190805）為江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品（經(jīng)UPLC-MS/MS測定含GP 10.59 mg/mL、GPA 0.71 mg/mL、GPGS 5.25 mg/mL、SZS 0.31 mg/mL、CGA 6.53 mg/mL、NCGA 2.72 mg/mL、CCGA 3.06 mg/mL、ICGAa 0.25 mg/mL、ICGAb 0.45 mg/mL、ICGAc 0.29 mg/mL、SL 1.01 mg/mL、SLA 46.70 mg/mL、SWS 0.71 mg/mL）。

1.2 儀器

Waters AQUITY UPLC?超高效液相色譜儀（美國Waters公司），配置自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱冷卻系統(tǒng)；AB Triple Quad 5500質(zhì)譜儀（美國AB公司），配置電噴霧電離源（Electron Spray Ionization，ESI）接口；用AB程序Analyst 1.6.2軟件進(jìn)行儀器控制和數(shù)據(jù)采集。Synergy UV超純水機(jī)（美國Millipore公司）；XPE26型分析天平（萬分之一，瑞士Mettler Toledo儀器有限公司）。KQ-400KDE超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；Centrifuge 5418高速臺(tái)式離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；V-32渦旋混合器（英國Grant bio公司）；DW-86L388J超低溫冰箱（青島海爾集團(tuán)）；5804R高速臺(tái)式離心機(jī)（德國eppendorf公司）。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分析采用Phoenix WinNonlin軟件。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，北京華阜康，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（25±2）℃，濕度為（50±10）%，12 h光照，晝夜交替，正常進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過（編號(hào)TCM-LAEC2020073），實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理要求。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 分別精密稱量“1.1”項(xiàng)的13個(gè)化合物和內(nèi)標(biāo)氯霉素對(duì)照品，置于10 mL棕色樣品瓶中，用甲醇溶解。GP、SLA儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為2 mg/mL，GPA、GPGS、SZS、CGA、CCGA、NCGA、ICGAa、ICGAb、ICGAc、SL、SWS、氯霉素儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為1 mg/mL。4 ℃環(huán)境避光儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)至室溫。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的配制 按比例精密移取各對(duì)照品儲(chǔ)備液至20 mL棕色樣品瓶中，其中GPA、SZS、ICGAb、ICGAc、SWS為300 μL，GPGS、SL、ICGAa為750 μL，CGA、CCGA、NCGA為1000 μL，GP為1500 μL，SLA為2250 μL，用甲醇定容至15 000 μL。4 ℃環(huán)境避光儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)至室溫。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控工作液的配制 取上述混合對(duì)照品溶液1 mL置于EP管中，以甲醇-水（50∶50）稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（100%、50%、25%、10%、5%、2.5%、1%、0.25%、0.1% A）和質(zhì)控工作液（75%、7.5%、0.3% A）。4 ℃避光儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)至室溫。

2.1.4 內(nèi)標(biāo)工作液的配制 取氯霉素儲(chǔ)備液20 μL，以甲醇-水（50∶50）稀釋至500 ng/mL。分裝后4 ℃環(huán)境避光儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)至室溫。

2.2 樣品處理

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品制備 取45 μL空白大鼠血漿[含2%甲酸、0.2%-(＋)-抗壞血酸]，加入5 μL混合對(duì)照品溶液，各化合物在標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品中質(zhì)量濃度見表1。

2.2.2 血漿樣品處理方法 取50 μL血漿樣品加入5 μL內(nèi)標(biāo)工作液，加入150 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋振蕩3 min，在10 000 r/min離心10 min，取上清液，以過0.22 μm有機(jī)濾膜后的含0.2%抗壞血酸（11.3 mmol/L）及0.5%甲酸的甲醇-水（50∶50）作為稀釋液（1∶3），稀釋后供UPLC-MS/MS分析。

2.3 色譜條件

采用Waters AQUITY UPLC C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），AQUITY UPLC BEH C18，VanGuardTM pre-Column3/PK保護(hù)?。? mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1.40 min，95% A；1.40～3.00 min，95%～90%A；3.00～5.50 min，90%～80%A；5.50～7.50 min，80%～78%A；7.50～9.00 min，78%～70%A；9.00～11.00 min，70%～95%A；采集時(shí)間11.00 min，體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器保持4 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

本研究中13個(gè)化合物易脫H＋而形成[M－H]?，采用電噴霧負(fù)離子（ESI?）、多反應(yīng)監(jiān)測模式（multi reaction minitoring，MRM）。干燥氣為氮?dú)?；氣簾氣壓力?41.3 kPa，離子源霧化氣壓力為379.21 kPa，離子源加熱輔助氣壓力310.2 kPa，碰撞氣壓力為48.3 kPa，噴霧電壓為–4500 V，加熱器溫度為500 ℃。

表1 13個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控血漿樣品的質(zhì)量濃度

針泵直接進(jìn)樣以確定目標(biāo)物的母離子，采用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，按照相應(yīng)強(qiáng)度由高到低的原則選取2個(gè)以上碎片作為子離子，并優(yōu)化其電壓參數(shù)后，擇優(yōu)作為定量離子對(duì)。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性 取6只不同大鼠混合空白血漿，按“2.2.2”項(xiàng)方法處理，采用UPLC-MS/MS分析，觀察大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)上述13個(gè)化合物的檢測是否存在干擾。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限（lower limit of quantification，LLOQ） 按“2.2”項(xiàng)方法制備并處理標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本，進(jìn)樣后根據(jù)每個(gè)分析物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)（），分析物的血漿濃度（，ng/mL）為橫坐標(biāo)，并使用（1/2）作為加權(quán)因子進(jìn)行加權(quán)法運(yùn)算，并進(jìn)行線性回歸分析。

2.5.3 殘留 取空白大鼠血漿，按“2.2.2”項(xiàng)方法處理后置于標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)后進(jìn)空白樣品以預(yù)估殘留，重復(fù)6次。

表2 13個(gè)化合物及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)

2.5.4 精密度和準(zhǔn)確度 按“2.2”項(xiàng)方法制備并處理低、中、高濃度質(zhì)控樣品（＝6），進(jìn)樣后記錄目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)測各化合物濃度以及批內(nèi)準(zhǔn)確度（ACw）和精密度（RSDw）；平行測定3批，計(jì)算批間準(zhǔn)確度（ACb）和精密度（RSDb）。準(zhǔn)確度（AC）為實(shí)測濃度均值與真實(shí)濃度的比值；精密度以實(shí)測濃度RSD表示。

2.5.5 提取回收率（extraction rate，ER）和基質(zhì)效應(yīng) （1）按“2.2”項(xiàng)方法制備并處理低、中、高濃度質(zhì)控樣品（＝6），進(jìn)樣后記錄待測物峰面積QC；（2）取空白血漿，按“2.2.2”項(xiàng)沉淀蛋白后取上清液，每195 μL上清液中加入混合對(duì)照品工作液5 μL，制備低、中、高濃度質(zhì)控樣品（＝6），進(jìn)樣后記錄待測物峰面積Asd；（3）取空白去離子水制備低、中、高質(zhì)控濃度溶液（＝6），進(jìn)樣后記錄待測物峰面積Am再按照公式計(jì)算ER、基質(zhì)效應(yīng)因子（matrix factor，MF）和內(nèi)標(biāo)歸一化的MF。

ER＝QCAm

MF＝AsdAm

內(nèi)標(biāo)歸一化的MF＝MF待測物/MFIS

2.5.6 穩(wěn)定性 按“2.2.1”項(xiàng)方法制備低、中、高濃度QC樣品（＝18），分別對(duì)處理前樣品室溫放置24 h、–80 ℃反復(fù)凍融3次，–80 ℃冷凍保存60天，處理后樣本室溫放置24 h，自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)24 h穩(wěn)定性考察。按“2.2.2”項(xiàng)處理后進(jìn)樣，記錄待測物在0 h峰面積積分值0及其穩(wěn)定性考察樣品峰面積積分值S，計(jì)算S/0值。

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

6只健康SD雄性大鼠，給藥前禁食12 h，自由飲水。給藥前（0 h）經(jīng)眼眶靜脈取血500 μL/只。大鼠的等效劑量換算后，按2 mL/kg劑量經(jīng)尾iv熱毒寧注射液，并于給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、9、12、24 h經(jīng)眼眶靜脈叢取血200 μL于含肝素鈉的EP管中，3000 r/min離心15 min，分離血漿至含少量-(＋)-抗壞血酸及甲酸的EP管中，血漿樣品中含有2% FA及0.2%-(＋)-抗壞血酸（11.3 mmol/L），–80 ℃凍存待測。大鼠給藥后2 h ig予0.9%氯化鈉溶液3 mL，4 h后進(jìn)食飲水。按“2.2.2”項(xiàng)方法處理樣品后進(jìn)樣，測定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)13個(gè)化合物的血藥濃度，繪制藥-時(shí)曲線。

2.7 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性 6只不同大鼠混合空白血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾13個(gè)化合物測定，該方法具有良好的專屬性。熱毒寧注射液中13個(gè)主要成分GP、GPA、GPGS、SZS、CGA、NCGA、CCGA、ICGAa、ICGAb、ICGAc、SL、SLA、SWS及內(nèi)標(biāo)物氯霉素保留時(shí)間分別為4.41、2.13、3.93、2.07、3.59、2.62、4.02、6.07、5.79、6.82、4.65、4.23、4.49、7.80 min，見圖2。

3.1.2 線性關(guān)系及LLOQ 大鼠血漿中13個(gè)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、濃度范圍及LLOQ見表3。在濃度范圍內(nèi)，所有化合物均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.1.3 殘留 該方法13個(gè)待測物成分經(jīng)ULOQ進(jìn)樣后，在空白樣本中殘留均小于LLOQ的20%。CHL在空白樣本的殘留效應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%。

3.1.4 準(zhǔn)確度和精密度 13個(gè)化合物準(zhǔn)確度偏差均在±15%，且批間、批內(nèi)RSD＜15%，符合生物樣品分析的要求[31]。

3.1.5 回收率與基質(zhì)效應(yīng) 低、中、高濃度質(zhì)控樣品的ER良好，均大于83%，RSD＜13%，未見內(nèi)源性物質(zhì)干擾檢測，符合生物樣本分析要求[31]。

3.1.6 穩(wěn)定性考察 低、中、高濃度血漿質(zhì)控樣品在處理前樣品室溫放置24 h（處理1）、處理前樣品?80 ℃反復(fù)凍融3次（處理2）、處理前樣品–80 ℃保存60 d（處理3）、處理后樣品室溫放置24 h（處理4）、處理后樣品進(jìn)樣盤放置24 h（處理5）、處理前樣品稀釋3倍（處理6）條件下穩(wěn)定性良好，S/0值均大于92%，符合生物樣品分析的要求。

3.2 熱毒寧注射液在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

健康SD大鼠尾iv熱毒寧注射液后，在血漿中可檢測到上述13個(gè)化合物，藥-時(shí)曲線如圖3所示，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表4。給藥后，13個(gè)化合物在血漿內(nèi)即達(dá)到最高濃度，其中SLA在血漿中暴露量最大，其后藥物濃度由高到低依次為GP、CGA、NCGA、CCGA、SL、GPGS、GPA、SWS、SZS、ICGAa、ICGAb、ICGAc，而后迅速下降，消除速率也各不相同。中藥化合物在體內(nèi)1/2較短，除GPA外，其他化合物在血漿中的1/2小于2 h，且各化合物在體內(nèi)消除速率快。GPA在給藥后15 min～2 h血藥濃度變化平緩?？Х弱？鼘幩犷愒隗w內(nèi)消除最快，4 h已接近或低于其LLOQ（2 ng/mL）。CCGA在體內(nèi)消除較NCGA快，6 h時(shí)間點(diǎn)采集的血漿樣品中CCGA濃度接近LLOQ（10 ng/mL）。ICGAa的d最小為（777.04±285.38）mL/kg，SLAd高達(dá)（27 920.66±3 425.49）mL/kg，藥物具有廣泛組織分布。

左：空白血漿基質(zhì)，中：血漿加對(duì)照品，右：血漿樣品；圖中出現(xiàn)多峰為同分異構(gòu)體所致。GP、GPA、GPGS、SZS、CGA、NCGA、CCGA、ICGAa、ICGAb、ICGAc、SL、SLA、SWS及內(nèi)標(biāo)物氯霉素保留時(shí)間分別為4.41、2.13、3.93、2.07、3.59、2.62、4.02、6.07、5.79、6.82、4.65、4.23、4.49、7.80 min

Left: blank rat plasma; Middle: blank rat plasma add standard solutions; Right: rat plasma sample. Multiple peaks in the figure is due to isomers.Rof GP、GPA、GPGS、SZS、CGA、NCGA、CCGA、ICGAa、ICGAb、ICGAc、SL、SLA、SWS and CHL (IS) is 4.41、2.13、3.93、2.07、3.59、2.62、4.02、6.07、5.79、6.82、4.65、4.23、4.49、7.80 min, respectively

圖2 13個(gè)化合物及內(nèi)標(biāo)UPLC-MS/MS色譜圖

Fig. 2 UPLC-MS/MS chromatograms of 13 compounds and IS

表3 熱毒寧注射液中13個(gè)化合物的線性關(guān)系及LLOQ

圖3 13個(gè)化合物的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(n＝6)

表4 13個(gè)化合物在健康SD大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)()

4 討論

熱毒寧注射液中各化合物濃度差異較大，為保證同時(shí)且準(zhǔn)確測定上述化合物含量，擴(kuò)大各化合物的定量范圍，無法采用統(tǒng)一濃度范圍，故預(yù)先將混合對(duì)照品工作液中各化合物比例按照注射液中各化合物比例進(jìn)行調(diào)整，設(shè)立了4種濃度范圍以適應(yīng)不同化合物在體內(nèi)的濃度變化。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)血漿樣品中13個(gè)成分的提取方法進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇沉淀蛋白效果優(yōu)，內(nèi)源性物質(zhì)干擾小，重現(xiàn)性好，樣品處理方法簡單，適合大批量樣品測定，測定結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。待測物中酚酸類化合物多，易被氧化及水解，由于其在酸性環(huán)境下穩(wěn)定，分別考察在樣品采集及處理過程中加入不同濃度的鹽酸、甲酸、抗壞血酸對(duì)樣品穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)樣品處理過程體系中維持0.5% FA及0.2%-(＋)-抗壞血酸濃度樣品穩(wěn)定性最好。流動(dòng)相選擇方面，選擇了純水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸水-甲醇進(jìn)行色譜條件考察，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脫方式條件下可以兼顧各化合物響應(yīng)強(qiáng)度，峰形較優(yōu)。由于待測物中綠原酸類（CGA、CCGA、NCGA）及咖啡酰奎寧酸類（ICGAa、ICGAb、ICGAc）存在同分異構(gòu)體結(jié)構(gòu)，加入0.1%甲酸有助于分離目標(biāo)峰，改善了同分異構(gòu)體的峰形?；衔颎P、GPGS、SZS、SWS在測定高濃度樣品后出現(xiàn)殘留，未對(duì)精密度及準(zhǔn)確度產(chǎn)生影響。13個(gè)化合物稀釋穩(wěn)定性良好，對(duì)超定量上限樣品采用空白大鼠血漿1∶3稀釋后復(fù)測方法可行。給藥后大鼠血漿中均可檢測到13個(gè)化合物，且濃度較高，藥-時(shí)曲線完整，給藥后血漿內(nèi)各化合物AUC比例與注射液制劑中濃度比例接近（圖4），說明其具有體外-體內(nèi)傳遞過程的可測性。結(jié)合表觀分布容積認(rèn)為上述化合物主要分布在組織中（d＞600 mL/kg）且有血漿-組織傳遞性，其靶部位傳遞過程及分布濃度有待進(jìn)一步探索。

本研究采用UPLC-MS/MS法對(duì)熱毒寧注射液13個(gè)潛在Q-Marker同時(shí)測定，靈敏性高、操作方便簡單、檢測迅速；化合物線性范圍良好，方法學(xué)驗(yàn)證符合要求，為后續(xù)研究建立了高質(zhì)量檢測方法。13個(gè)化合物可在中藥材、熱毒寧注射液和大鼠血漿內(nèi)檢測到，適用于體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究，符合Q-Marker可測性要求，且具有藥材-制劑-血漿-組織/靶組織傳遞性，為熱毒寧注射液Q-Marker深入探索奠定了研究基礎(chǔ)。

圖4 注射液中13個(gè)化合物濃度(A) 與大鼠血漿內(nèi)各化合物質(zhì)量濃度(B)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Simultaneous determination of 13 potential Q-Markers in Reduning Injection by UPLC-MS / MS in rats plasma and its application to a pharmacokinetic study in health rats

WANG Can1, WANG Bao-he2, HUANG Yu-hong2, LI Zi-qiang2, ZHANG Han1

1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300250, China

Based on the concept of traditional Chinese medicine quality marker (Q-Marker), a method for simultaneous determination of 13 potential Q-Markers in plasma was established by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The method was also used to determine the plasma concentration of 13 potential Q-Markers and their pharmacokinetics in health rats given Reduning Injection (熱毒寧注射液) via tail vein in order to prove the detectability of transfer processand.Waters AQUITY UPLC C18column (100 mm×2.1 mm, 1.7μm) was used. The mobile phase was 0.1% formic acid water-acetonitrile gradient elution, the flow rate was 0.3 mL/min, the column temperature was 35℃, the temperature was 4℃, and the injection volume was 2 μL. Using chloramphenicol as an internal standard, 13 Q-Markers in plasma (geniposide, geniposidic acid, genipin-1-β--gentiobioside, shanzhiside, chlorogenic acid, neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid B, 4, 5-dicaffeoylquinic acid, secoxyloganin, secologanic acid, and sweroside) were quantified simultaneously by using electrospray ion source (ESI), negative ion source, and multiple reaction monitoring (MRM).The non-compartment model was used to calculate the pharmacokinetic parameters in Phoenix WinNonlin8.1 software.The 13 compounds showed good linear relationship in the detection range. The recovery rate, matrix effect, precision, accuracy and stability of the method all match the requirements of biological samples detection. The results showed that the above 13 compounds could be detected in the plasma of rats injected with Reduning Injection via tail vein. The exposure concentration of secologanic acid was the highest, followed by concentration of geniposide and chlorogenic acid. All compounds owned short half-life and quick elimination rate, and large apparent distribution volume which indicated that they were widely distributed in tissues.The method can simultaneously quantify 13 compounds of Reduning Injection in plasma, which proves the detectability of the above components’ transfer process fromto. The pharmacokinetic study showed that the 13 compounds also had plasma tissue/target organ transfer property, which can be used as potential Q-Marker for safety and efficacy evaluation of Reduning Injection.

Q-Marker; Reduning Injection; UPLC-MS/MS; pharmacokinetics; geniposide, geniposidic acid, genipin-1-β--gentiobioside;shanzhiside; chlorogenic acid; neochlorogenic acid; cryptochlorogenicacid; isochlorogenic acid A; isochlorogenic acid B;4, 5- dicaffeoylquinic acid; secoxyloganin;secologanic acid; sweroside

R285.5

A

0253 - 2670(2021)09 - 2653 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.016

2021-04-09

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2018ZX09734-002）；天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（18JCQNJC83800）；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（17ZXXYSY00060）

王 璨，女，在讀博士研究生，主要從事心腦血管疾病中醫(yī)藥防治、中藥臨床藥理研究及中藥臨床評(píng)價(jià)工作。

王保和，男，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師。研究方向?yàn)樾哪X血管疾病中醫(yī)藥防治、中藥臨床藥理研究及中藥臨床評(píng)價(jià)工作。

李自強(qiáng)，男，副研究員。研究方向?yàn)橹兴幩巹?dòng)學(xué)研究。E-mail: lzqpharm@126.com

[責(zé)任編輯 王文倩]