吳 梅 侯小娟 再努拉·艾未肉拉 郭小平 唐 亮

鼻咽癌(nasopharygeal carcinoma，NPC)是頭頸部常見的惡性腫瘤。NPC在美國和歐洲發(fā)生率較低，在東南亞及中國華南地區(qū)高發(fā)[1]。NPC的致病因素除環(huán)境因素外，還包括遺傳因素和病毒感染等生物因素[2]。有癥狀的NPC患者，就診時多數(shù)已是進展期，即使行根治性的放化療，由于腫瘤對放射線抵抗或耐藥導(dǎo)致的局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險，仍是臨床面臨的棘手問題，也是影響患者生存的主要因素[3]。如何有效區(qū)分出高危復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移患者，運用相應(yīng)的分子靶向藥物是NPC個體化精準(zhǔn)治療的新策略[4]。針對鼻咽癌的早期診斷及預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)志物研究已經(jīng)開展，但臨床運用效果還有待驗證[5]。

人多梳蛋白2(human polycomd 2, HPC2)基因又名染色盒同源物4(chromobox homolog 4, CBX4)，是多梳蛋白家族(polycomb group, PcG)的重要成員之一，常與其他PcG分子形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，發(fā)揮其多種生物學(xué)功能[6]。同時，HPC2還是一種小泛素分子修飾物(small ubiquitin modifier, SUMO)，對作用底物具有類泛素化調(diào)節(jié)功能[7]。據(jù)相關(guān)文獻報道，HPC2/CBX4與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但是在鼻咽癌中的表達及臨床預(yù)后作用尚未見報道[8]。本研究從臨床樣本著手，運用蛋白印跡及免疫組化法，檢測HPC2在鼻咽癌組織中的表達情況，聯(lián)合檢測Ki67，結(jié)合臨床病理及隨訪資料判斷其臨床預(yù)后價值。

資料與方法

1.一般資料：收集內(nèi)鏡活檢的8例新鮮鼻咽癌組織標(biāo)本(男性7例，Ⅱ期1例，Ⅲ期6例；女性1例Ⅲ期)，及同期8例活檢排除腫瘤的鼻咽上皮組織，活檢組織取材后立即放入液氮中凍存?zhèn)溆谩Ｊ占陆灾螀^(qū)人民醫(yī)院收治的126例鼻咽癌患者，其中男性99例，患者年齡14～88歲，平均年齡49.5歲，女性37例，患者年齡27～73歲，平均年齡51.3歲，均行根治性放射治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有存檔的組織蠟塊標(biāo)本，病理學(xué)確診為鼻咽癌，無其他惡性腫瘤病史；②所有患者入院前均未接受任何特異性抗腫瘤治療；③患者腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移經(jīng)鼻內(nèi)鏡活檢，MRI或CT影像檢查證實；④患者因鼻咽癌導(dǎo)致死亡。查閱整理病歷資料，登記隨訪數(shù)據(jù)。無進展生存定義為從確診之日起至放療后隨訪過程中出現(xiàn)腫瘤局部復(fù)發(fā)、區(qū)域淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時間截止，或至末次隨訪時間?？偵娑x為從確診之日起至放療后隨訪過程中發(fā)生死亡時間截止，或至末次隨訪時間。隨訪數(shù)據(jù)通過查閱病歷或電話隨訪登記。本研究的實施取得新疆自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審批同意，患者簽署組織標(biāo)本使用知情同意書。組織學(xué)分類按照2006年世界衛(wèi)生組織(WHO)頭頸部腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，TNM分期采用第8版AJCC/UICC鼻咽癌分期系統(tǒng)[9，10]。

2.Wertern blot法：采用RIPA裂解液提內(nèi)鏡下取活檢組織總蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒購自南京凱基公司(Cat no.23227)，檢測并配平蛋白濃度。樣品總蛋白用SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，之后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉，HPC2兔抗人多克隆抗體(Cat no.A302-355A, 1∶2000, 美國Bethyl公司)和β-Actin鼠單克隆抗體(1∶10000)4℃過夜。洗膜后放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗室溫孵育，再洗膜后ECL(Cat no.P0018F，碧云天公司)化學(xué)發(fā)光液顯影，凝膠電泳成像儀采集圖像保存。Image lab軟件分析蛋白條帶，將HPC2蛋白印跡條帶的灰度與對應(yīng)的β-actin的灰度值比較，用該比值表示HPC2蛋白的表達水平。

3.免疫組化染色法：將調(diào)取的存檔鼻咽癌組織蠟塊切片并HE染色后，由病理專科醫(yī)生復(fù)診審核。審核無誤后，進一步做免疫組化染色，按照SP兩步法標(biāo)準(zhǔn)步驟進行，采用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)恒壓抗原修復(fù)，非免疫性山羊血清(中衫金橋)封閉。分別滴加兔抗人特異性HPC2多克隆抗體(貨號：IHC-00668, 美國Bethyl公司，稀釋1∶100)，兔抗人特異性Ki67多克隆抗體(貨號：BS90769，美國Bioworld公司，稀釋1∶200)，PBS作為空白對照，用山羊血清做陰性對照，用已知染色強陽性的人乳腺癌組織切片作為陽性對照。

4.免疫組化結(jié)果及評分標(biāo)準(zhǔn)：HPC2采用免疫染色半定量法評分，依據(jù)陽性染色細(xì)胞的信號強度和陽性細(xì)胞所占細(xì)胞百分比分別評分[9]。染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核未出現(xiàn)陽性顯色為0分；細(xì)胞核中出現(xiàn)高于背景的淡黃色為1分；棕黃色為2分；黃褐色為3分。每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，算出陽性細(xì)胞平均百分比并計分：無陽性染色細(xì)胞為0分；10%～25%為1分；25%～50%為2分；50%～75%為3分；>75%為4分。由兩位病理醫(yī)師采用盲法單獨閱片評分，評分結(jié)果不一致的，共同商議后決定最終評分。將上述兩個分值的乘積定為最終分值，所得評分的中位數(shù)為6，因此確定≤6分為低表達組，>6分為高表達組。Ki67評分采用腫瘤細(xì)胞核陽性染色百分比評分[10]：≤60%分為低表達組，>60%為高表達組。

結(jié) 果

1.HPC2蛋白在新鮮組織中表達：將8對新鮮NPC組織和同期體檢的非腫瘤鼻咽上皮組織采用Western blot法檢測，NPC組織中HPC2表達為1.830±0.125，鼻咽上皮組織為0.320±0.065,HPC2在NPC組織中表達明顯高于鼻咽上皮組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 HPC2在鼻咽癌與鼻咽上皮組織中的表達

2.免疫組化法檢測HPC2 及Ki67在鼻咽癌組織中的表達狀態(tài)：鼻咽癌組織中HPC2及Ki67蛋白表達的陽性染色，主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞核，表現(xiàn)為細(xì)胞核中存在黃色至褐色的反應(yīng)顆粒(圖2)。HPC2在鼻咽癌組織中高表達為55.6%(70/126)；低表達為44.4%(56/126)；Ki67在鼻咽癌組織中高表達為61.9%(78/126)；低表達為38.1%(48/126)。

圖2 免疫組化檢測 HPC2和Ki67在鼻咽癌組織中的表達(SP，×400)

3.鼻咽癌組織中HPC2和Ki67表達相關(guān)性：每例患者同時檢測HPC2和Ki67兩個指標(biāo)，根據(jù)HPC2和Ki67表達情況，將結(jié)果分為低表達組和高表達組。HPC2和Ki67表達相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，兩指標(biāo)的表達之間呈正相關(guān)(r=0.354，P<0.01，圖3)。

圖3 免疫組化檢測鼻咽癌組織中HPC2和Ki67表達的相關(guān)性

4.HPC2免疫表達與臨床病理因素的關(guān)系：本組NPC患者的年齡范圍為10～80歲，中位年齡約48歲。截至末次隨訪，所有患者均獲得完整隨訪數(shù)據(jù)，中位隨訪時間46個月(2～97個月)，復(fù)發(fā)46例(46/126，36.5%)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移13例(13/126，10.3%)，死亡49例(49/126，38.9%)，均為鼻咽癌導(dǎo)致死亡。與HPC2的表達相關(guān)的因素有T分期(P=0.012)、N分期(P=0.001)、M分期(P=0.026)、TNM分期(P=0.036)、復(fù)發(fā)狀態(tài)(P=0.000)及Ki67的表達(P=0.000)。不同性別、年齡、族別、吸煙史、病理分型與HPC2的表達無明顯關(guān)系(表1)。

表1 HPC2表達與鼻咽癌臨床病理因素的關(guān)系

5.HPC2聯(lián)合Ki67表達評估鼻咽癌預(yù)后：為進一步驗證HPC2和Ki67聯(lián)合檢測對鼻咽癌預(yù)后風(fēng)險預(yù)測作用，將NPC患者分成3組，即HPC2和Ki67均高表達為第1組；HPC2高表達Ki67低表達組或HPC2低表達Ki67高表達為第2組；HPC2和Ki67均低表達為第3組。3個組的5年無進展生存率分別為18.2%、55.8%和86.7%，無進展生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-RankMantel-COX=38.24，P=0.000，圖4A)。3個組的5年總生存率分別為23.1%、62.2%和95.2%，總生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-RankMantel-COX=41.43，P=0.000，圖4B)。

圖4 Kaplan-Meier法分析鼻咽癌組織中HPC2與Ki67表達狀態(tài)對患者生存的預(yù)后作用

討 論

NPC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是多個基因參與的多步驟過程，如何準(zhǔn)確預(yù)測，選擇合適的干預(yù)措施和時機是患者臨床獲益的關(guān)鍵。發(fā)掘NPC發(fā)生、發(fā)展過程中主要驅(qū)動基因，篩選有效的分子治療靶點是目前研究的焦點問題[11,12]。據(jù)相關(guān)報道，EBV-DNA是有效的診斷、監(jiān)測指標(biāo)，但對于EBV陰性的NPC來說，仍需要有效的替代標(biāo)志物[13,14]。近年來HPC2/CBX4在腫瘤領(lǐng)域的研究逐漸增多，它既是組成PcG蛋白核心分子，也是一種重要的泛素修飾SUMO E3連接酶。在人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)HPC2/CBX4具有促癌和抑癌的雙重功能，在腫瘤生物學(xué)功能的調(diào)控中，其可以和SUMO化底物相互作用也可以通過直接作用于某些轉(zhuǎn)錄因子的啟動子區(qū)域，進而影響其轉(zhuǎn)錄及功能。

目前，大多數(shù)研究結(jié)果顯示HPC2/CBX4是一種參與了腫瘤增殖和血管生成的基因，據(jù)報道CBX4在肝細(xì)胞癌較癌旁組織表達上調(diào)，促進細(xì)胞周期進展及腫瘤增殖；在乳腺癌中通過Notch1通路促進腫瘤的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，HPC2/CBX4在鼻咽癌組織的表達較鼻咽非腫瘤組織的表達上調(diào)，可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。異常豐富的血供是惡性腫瘤的重要特征，據(jù)相關(guān)文獻報道，CBX4 能通過SUMO化修飾調(diào)控HIF-1α活性，促進肝細(xì)胞癌血管增生。然而CBX4在腫瘤轉(zhuǎn)移方面的功能不盡一致。最近有報道顯示，CBX4參與了骨肉瘤的轉(zhuǎn)移，CK1α/CBC4是抑制轉(zhuǎn)移的有效靶點[15]。在腎透明細(xì)胞癌中，CBX4與HDAC1相互作用結(jié)合于KLF6基因啟動子抑制轉(zhuǎn)錄，促進腫瘤生長轉(zhuǎn)移，CBX4調(diào)節(jié)BMI1介導(dǎo)肺癌轉(zhuǎn)移[16，17]。與之相反，在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)，CBX4卻可以通過募集HDAC3抑制RUNX2轉(zhuǎn)錄，從而抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)，HPC2的表達與鼻咽癌的T、N、M分期及Ki67表達有關(guān)，生存分析發(fā)現(xiàn)HPC2與 Ki67的表達狀態(tài)與腫瘤無進展生存及總生存關(guān)系密切，提示HPC2可能參與了NPC的疾病進展。為初步探討HPC2是否與NPC腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)，免疫組化聯(lián)合檢測了Ki67的表達。Ki67蛋白是MKI67基因編碼的蛋白，在增殖細(xì)胞核表達，是一種腫瘤增殖指標(biāo)，反映細(xì)胞有絲分裂能力。不同腫瘤中Ki67的預(yù)后作用有所不同，有報道稱Ki67與放射線抵抗有關(guān)，是局部進展期NPC的不良預(yù)后因素[18]。然而，在大樣本量的結(jié)腸癌研究發(fā)現(xiàn)，Ki67的高表達是良好預(yù)后的獨立預(yù)測因素。在前列腺癌發(fā)現(xiàn)Ki67免疫組化染色測量的腫瘤生長分?jǐn)?shù)是小體積或低級別前列腺術(shù)前活檢的獨立預(yù)后因素。Ki67表達定量以陽性細(xì)胞所占比例評定，通常在腫瘤良惡性鑒別和判斷腫瘤增殖使用。本研究中Ki67高表達占61.9%，表明NPC 的惡性增殖能力強。相關(guān)分析顯示，HPC2與Ki67的表達有相關(guān)性，且呈正相關(guān)，提示HPC2可能與NPC的腫瘤增殖有關(guān)。當(dāng)HPC2與Ki67在NPC組織中均呈高表達時，患者風(fēng)險最高，無進展生存和總生存率最低；當(dāng)HPC2與Ki67均呈低表達時，患者風(fēng)險最低，無進展生存和總生存率最高；當(dāng)兩者表達不一致時，患者無進展生存和總生存率介于兩者之間，屬中度風(fēng)險。因此，聯(lián)合檢測HPC2與Ki67的表達，能有效將不同風(fēng)險的NPC患者區(qū)分開來，供臨床治療做決策，尤其對預(yù)后最差的和中度風(fēng)險的患者及時監(jiān)測，盡早干預(yù)，改善生活質(zhì)量，提高生存率。本研究的局限性在于樣本量還不夠大，而且NPC早期的病例數(shù)偏少。因此，HPC2在早期NPC的應(yīng)用還可以加大早期病例樣本數(shù)進行深入分析。

綜上所述，HPC2表達與NPC腫瘤的大小、侵犯范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)和是否合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分期因素密切相關(guān)，其高表達提示腫瘤進展及NPC預(yù)后不良，與Ki67聯(lián)合檢測利于準(zhǔn)確判斷預(yù)后風(fēng)險及臨床個體化干預(yù)。