劉元濤，劉一鵬，張志豪，王建瑞，劉 宇

（魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東煙臺264025）

小香菇屬（Lentinellus P.Karst.）隸屬于擔(dān)子菌門 （Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 紅菇目 （Russulales） 耳匙菌科 （Auriscalpiaceae）[1-2]。該種的主要特征是子實(shí)體呈扇形或貝殼形，菌柄短、側(cè)生，菌褶延生、邊緣撕裂或鋸齒狀，菌肉稍有辛辣味；擔(dān)孢子近球形，表面具疣突，淀粉質(zhì)，孢子印白色；側(cè)生囊狀體稀少，披針形至紡錘形。菌髓組織具有膠質(zhì)菌絲和生殖菌絲，部分有骨架菌絲；生殖菌絲具有鎖狀聯(lián)合，骨架菌絲細(xì)胞壁上有淀粉質(zhì)的凸起[3]。小香菇屬有3個種為食用菌[4]，1個種為藥用菌[5]，且含有多種揮發(fā)性物質(zhì)[6-8]及多種活性成分，具有抑制腫瘤細(xì)胞的藥用價值[9]。

中華小香菇（Lentinellus sinensis R.H.Petersen）是小香菇屬中個體中到大型的一個種。具側(cè)生柄或無柄，非木質(zhì)化[1]，孢子長約5 μm，寬橢圓型至近球型，菌蓋或菌柄表面生有厚垣孢子。該種可食用[4]，但野生資源分布較少，主要分布于我國的長白山地區(qū)，常生于腐木上[12]。關(guān)于該物種開發(fā)利用方面的研究數(shù)據(jù)尚未見報(bào)道。

研究物種生物學(xué)特性的方法很多，如響應(yīng)面法[13]、單因素試驗(yàn)法[14]、正交試驗(yàn)法[15]和字母標(biāo)記法[16]等。在食用菌相關(guān)研究中，鄒莉等[17]利用單因素試驗(yàn)的方法研究了亞側(cè)耳的生物學(xué)特性；王航等[18]利用字母表法和單因素試驗(yàn)法研究了羊肚菌的生物學(xué)特性；彭智華等[19]利用單因素試驗(yàn)法研究了大杯蕈的生物學(xué)特性；湯洪敏等[20]利用單因素試驗(yàn)法和顯微鏡觀察研究了大白口蘑的生物學(xué)特性。因此，通過采用單因素試驗(yàn)法和正交試驗(yàn)法，對中華小香菇的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以確定中華小香菇菌絲體生長所需要的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件，以期為未來中華小香菇藥用價值和生防藥劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株采自吉林省長白山自然保護(hù)區(qū)，組織分離純化后獲得純菌種，提取并擴(kuò)增其ITS序列，將結(jié)果通過GenBank進(jìn)行比對，最后鑒定該菌株為中華小香菇。菌株編號為20140827-27，現(xiàn)保存于魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院菌種保藏庫。

1.2 培養(yǎng)基

1）溫度試驗(yàn)和pH試驗(yàn)均使用PDA培養(yǎng)基，配方參照參考文獻(xiàn)[21]的方法。

2） 不同碳源、氮源的培養(yǎng)基配方：在PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，調(diào)整碳氮源的種類，其他成分保持不變。其中，碳源分別為葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和淀粉，氮源分別為蛋白胨、酵母浸膏、硫酸銨、牛肉膏、脲素和硝酸鈉。

3）正交試驗(yàn)培養(yǎng)基配方根據(jù)四因素五水平配方進(jìn)行方案設(shè)計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 碳氮源試驗(yàn)

碳氮源試驗(yàn)方法參照參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行。將純化后的中華小香菇菌株接入含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于避光、22℃的環(huán)境下進(jìn)行活化。待菌絲長滿培養(yǎng)基表面后，用直徑5 mm的打孔器打孔，得到大小相同的圓形菌塊，然后分別接種到不同的碳氮源培養(yǎng)基上，置于22℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每個處理組進(jìn)行5次重復(fù)。

菌絲測量方法參照參考文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行。菌絲開始萌發(fā)的時間記作第1天，用畫線法每隔2 d測量一次菌絲長度；測量時菌塊中心畫十字，隨后于菌絲生長到的地方作標(biāo)記，待有菌絲最先長滿平板，則試驗(yàn)結(jié)束。同時在培養(yǎng)過程中觀察菌絲的生長狀況。

1.3.2 pH試驗(yàn)

pH試驗(yàn)參照參考文獻(xiàn)[23]的方法進(jìn)行。將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至4、5、6、7、8、9、10、11、12，共設(shè)9個梯度，后進(jìn)行高溫滅菌。接種、培養(yǎng)、測量方法同1.3.1，每個處理組進(jìn)行5次重復(fù)。

1.3.3 溫度試驗(yàn)

溫度試驗(yàn)參照參考文獻(xiàn)[24]的方法進(jìn)行。將接種后的培養(yǎng)基，分別放置于10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、32℃共6個梯度的恒溫培養(yǎng)箱中。接種、培養(yǎng)、測量方法同1.3.1，每個處理重復(fù)5次。

1.3.4 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)參照參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。根據(jù)4組單因素試驗(yàn)結(jié)果，選出菌絲生長狀況較好的5組條件，依據(jù)正交試驗(yàn)4因素5水平的組合進(jìn)行試驗(yàn)。培養(yǎng)、接種、測量方法同1.3.1，每個處理組進(jìn)行5次重復(fù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)中的各處理組的重復(fù)數(shù)據(jù)，均采用DPS軟件進(jìn)行方差分析，最后統(tǒng)計(jì)結(jié)果中處理組的差異顯著性比較，采用字母標(biāo)記法表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 不同碳源處理對中華小香菇菌絲生長的影響

中華小香菇的菌絲長度隨時間變化的生長曲線見圖1。

圖1 中華小香菇菌絲在不同碳源培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 The mycelial growth curve of Lentinellus sinensis in different carbon source medium

如圖1所示，中華小香菇菌絲在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上不能萌發(fā)，在其他碳源培養(yǎng)基上均能夠正常生長。在菌絲測量前6天，菌絲萌發(fā)初期，菌絲生長長度差異較小。葡萄糖組、麥芽糖組、果糖組和淀粉組菌絲生長速度隨著時間的增長而變快，這四組與蔗糖組和乳糖組相比差異顯著。生長28 d后，麥芽糖培養(yǎng)基上菌絲基本長滿。中華小香菇菌絲在6種碳源培養(yǎng)基上的生長由快到慢為：麥芽糖=果糖=葡萄糖＞蔗糖＞乳糖（不萌發(fā)）。

根據(jù)菌絲長度統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，不同處理組菌絲生長長度的差異顯著性采用字母標(biāo)記法進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 不同碳源處理組菌絲長度的差異顯著性Tab.1 Significant difference of mycelial growth length between different carbon sources groups

如表1所示，在0.05水平上，麥芽糖、果糖、葡萄糖和可溶性淀粉4組之間無極顯著差異，麥芽糖、果糖和可溶性淀粉組之間呈顯著差異；蔗糖處理組的菌絲萌發(fā)晚，與其他各組形成極顯著差異。在0.01水平上，麥芽糖組、果糖組、葡萄糖組和可溶性淀粉組4組之間無顯著差異；蔗糖組與其他組之間差異顯著。根據(jù)菌絲生長勢情況，菌絲生長潔白、濃密且均勻的是麥芽糖、果糖、葡萄糖3個處理組，生長情況最優(yōu)；可溶性淀粉和蔗糖處理組菌絲較白且不均勻，長勢稍差。菌絲在麥芽糖、果糖、葡萄糖3種碳源培養(yǎng)基上的生長情況均最好，差異不大。結(jié)合菌絲長度和生長勢來看，在單因素試驗(yàn)中，最適中華小香菇菌絲生長的碳源為葡萄糖、果糖和麥芽糖，蔗糖和乳糖最差。

2.1.2 氮源對中華小香菇菌絲生長的影響

在不同氮源下中華小香菇菌絲長度隨時間變化的生長曲線見圖2。

圖2 中華小香菇菌絲在不同氮源培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.2 The mycelial growth curve of Lentinellus sinensis in different nitrogen source medium

如圖2所示，中華小香菇菌絲在酵母浸膏、牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨、硝酸鈉等氮源培養(yǎng)基上均能夠正常生長；在脲素培養(yǎng)基上不能生長。菌絲在酵母浸膏培養(yǎng)基上最先萌發(fā)，且生長最快，明顯優(yōu)于其他各組。28 d后，菌絲在酵母浸膏培養(yǎng)基上基本長滿培養(yǎng)皿。

將菌絲長度統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，不同處理組菌絲長度的差異顯著性采用字母標(biāo)記法進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 不同氮源處理組菌絲長度的差異顯著性Tab.2 Significant difference of mycelial growth length between different nitrogen sources groups

如表2所示，菌絲在6種氮源培養(yǎng)基上的生長快慢順序大致為：酵母浸膏＞牛肉膏＞硫酸銨＞蛋白胨＞硝酸鈉＞脲素（不萌發(fā)）。差異性分析得出，0.05水平和0.01水平上，酵母浸膏組與其他5組相比均有極顯著差異；牛肉膏組和硫酸銨組之間無顯著差異；蛋白胨組和硝酸鈉組之間無顯著差異；硫酸銨組和蛋白胨組之間呈顯著差異。菌絲生長勢分析，酵母浸膏處理組上菌絲濃密、均勻、長勢最好，牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨3個組菌絲粗壯且不均勻，長勢稍差。菌絲在酵母浸膏培養(yǎng)基上的生長狀況最優(yōu)。

2.1.3 不同pH對于菌絲生長的影響

不同pH下中華小香菇菌絲長度隨時間變化的生長曲線見圖3。

圖3 中華小香菇菌絲在不同pH條件中的生長曲線Fig.3 The mycelial growth curve of Lentinellus sinensis in different pH conditions

如圖3所示，菌絲在不同pH的培養(yǎng)基上均能夠正常生長。當(dāng)pH為6時，菌絲最早萌發(fā)，生長最快，菌絲濃密、較厚；當(dāng)pH在6～8時，隨pH增大，菌絲生長逐漸緩慢，生長勢變?nèi)?；?dāng)pH為5和9～12時，菌絲生長和生長勢隨之遞減，生長勢差異不明顯。當(dāng)pH為4時，菌絲在培養(yǎng)基上萌發(fā)最晚且稀疏，氣生菌絲增多，生長勢最差。分析試驗(yàn)結(jié)果得出，菌絲在9種pH培養(yǎng)基上的生長快慢順序大致為：pH 6＞pH 7＞pH 8＞pH 9＞pH 5＞pH 10＞pH 11＞pH 12＞pH 4。

將第28天菌絲長度統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，不同處理組菌絲長度的差異顯著性采用字母標(biāo)記法進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，0.05水平和0.01水平的結(jié)果大致相同，pH為6和7的2組與其他各組相比均有顯著差異，但無極顯著差異；pH為7和8的2組與其他各組相比均有顯著差異，但無極顯著差異；pH為8和9的2組間無顯著差異；pH為 5、10、11、12的4組間無顯著差異；pH 4與其他各組相比均有極顯著差異。綜合菌絲長度和生長勢來看，在pH 6～7時，菌絲生長情況最好。

表3 不同pH條件下菌絲長度的差異顯著性Tab.3 Significant difference of mycelial growth length in the different pH conditions groups

2.1.4 不同溫度對于菌絲萌發(fā)的影響

中華小香菇菌絲在不同溫度條件下隨時間變化的生長曲線見圖4。

圖4 中華小香菇菌絲在不同溫度條件下的生長曲線Fig.4 The mycelial growth curve of Lentinellus sinensis in different temperature condition

如圖4所示，中華小香菇菌絲在25℃下生長最快，菌絲潔白、濃密，生長勢最好；其次為20℃，且2組之間菌絲生長情況差異不顯著；10℃～20℃之間時，隨溫度升高，菌絲生長漸漸變快，菌絲稀疏，氣生菌絲增多；32℃時，菌絲生長緩慢，溫度對其生長抑制作用更加明顯；在溫度過高或過低的情況下中華小香菇菌絲生長都受到影響。菌絲在6種溫度下的生長快慢順序大致為：25℃＞20℃＞28℃＞15℃＞10℃＞32℃ （不萌發(fā)）。

將第26天菌絲長度統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，不同處理組菌絲長度的差異顯著性采用字母標(biāo)記法進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。

表4 不同溫度條件下菌絲長度的差異顯著性Tab.4 Significant difference of mycelial growth length in the different temperature conditions groups

由表4可知，在0.05水平上，25℃與其他處理組之間有顯著差異；20℃與其他處理組之間有顯著差異；28℃和15℃兩組之間無顯著差異，與其他各組相比呈顯著差異；10℃和32℃兩組之間差異顯著，與其他各組相比呈顯著差異。在0.01水平上，20℃和25℃兩組之間無顯著差異，與其他各組相比呈顯著差異；28℃、15℃和10℃三組之間無顯著差異；32℃與其他組之間呈顯著差異。綜合菌絲生長勢和長度來看，20℃～28℃是中華小香菇菌絲生長的最佳溫度。

2.2 正交試驗(yàn)

結(jié)合以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，從中分別挑選出較適合中華小香菇菌絲生長的4個條件，設(shè)計(jì)4因素5水平的正交試驗(yàn)，共計(jì)25組。4因素5水平表見表5。

表5 正交試驗(yàn)4因素5水平表Tab.5 The orthogonal test table of 4 factors and 5 levels

培養(yǎng)26 d后，不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)中華小香菇菌絲生長狀況的正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析見表6。

表6 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲生長的正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析Tab.6 The results of direct-viewing analysis of mycelial growth in the different culture medium

由表6可知，菌絲在25組處理的培養(yǎng)基上均可以正常生長，但菌絲長度和生長勢上各有不同，第3組、第8組、第13組的菌絲長度均大于4 cm，其中第8組菌絲長度最長，其次是第13組和第3組，這三組間的菌絲長度差異不顯著。根據(jù)生長勢觀察，這三組菌絲潔白濃密，長勢最好。正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果得出，中華小香菇菌絲培養(yǎng)最適條件為：碳源為果糖，氮源為酵母浸膏，溫度為25℃，pH 6。通過極差值可知，4種因素對于菌絲生長的影響從大到小依次為：氮源＞溫度＞pH＞碳源。

3 結(jié)論

結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的直觀分析以及極差比較得出，中華小香菇菌絲培養(yǎng)的最適條件為：碳源為麥芽糖、果糖和葡萄糖，氮源為酵母浸膏，pH為6.5，溫度為20℃～28℃。

中華小香菇主要分布于長白山地區(qū)，是一種典型的木腐菌。在生物學(xué)特性研究試驗(yàn)中，中華小香菇菌絲體呈現(xiàn)出具有較廣泛的碳源、氮源營養(yǎng)適應(yīng)性和酸堿環(huán)境適應(yīng)性。然而在開發(fā)利用菌絲體生產(chǎn)時還需選擇最佳的條件組合。到目前為止，中華小香菇的生物學(xué)特性研究目前還僅限于其菌絲體在固體培養(yǎng)基中生長發(fā)育的研究，還需進(jìn)一步開展其菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)以及出菇栽培等條件優(yōu)化研究。