趙肖靈，王繼濤，張小沖，張二鵬，李金龍，陳威，張昆鵬，張博，陳欣欣，劉登湘

（河北醫(yī)科大學附屬邢臺市人民醫(yī)院 門脈高壓研究中心，河北 邢臺 054001）

門靜脈高壓癥（portal hypertension，PH）是影響肝硬化患者臨床預后的重要因素，其嚴重程度決定了相關并發(fā)癥（如腹腔積液、食管胃靜脈曲張破裂出血、肝性腦病、肝腎綜合征等）的發(fā)生和發(fā)展[1-3]。據報道，全球患有肝硬化的人數超過3億[4]，因肝硬化導致的死亡人數達120萬[5]，且近年來死亡人數呈上升趨勢[6-7]。門靜脈壓力的持續(xù)升高是門靜脈血流由肝臟回流到下腔靜脈時受阻而引起的[8]。PH是肝硬化患者從代償期向失代償期過渡的特征性標志[9]，臨床顯著性PH患者常出現(xiàn)腹水、食管胃靜脈曲張破裂出血、細菌性腹膜炎、肝腎綜合征、肝性腦病

等[10-11]。

PH的診斷金標準為肝靜脈壓力梯度（hepatic venous pressure gradient，HVPG），其測量方式是有創(chuàng)的，且對操作者的水平要求較高[3，12]。因此，臨床上PH患者常因出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥如急性靜脈曲張破裂出血、頑固性腹水等以后，才得以確診[13]。而在無顯著并發(fā)癥的早期門靜脈高壓階段，HVPG檢測接受度更低，并且對于服用門脈降壓藥物，行內鏡、介入或外科手術治療后需動態(tài)監(jiān)測門脈壓力情況的患者難以重復實施。因此，針對PH早期診斷、無創(chuàng)監(jiān)測等方面一直是國內外學者的研究熱點之一。更重要的是，PH的診治模式不再是單一學科經驗式診療，而是逐漸轉變?yōu)槎鄬W科綜合協(xié)作診療模式。PH全病程治療方式將藥物、內鏡治療、外科手術、介入治療及肝移植等治療方式序貫結合，以實現(xiàn)優(yōu)勢互補[11]。PH患者病程長、疾病涉及多個學科，會產生大量的臨床數據和各類臨床標本。因此，建立、維護和管理PH標本庫，標準、規(guī)范地保存PH樣本，對于PH發(fā)生的早期診斷和無創(chuàng)監(jiān)測具有重要意義[14]。

生物標本庫是一類集中保護人類材料的生物庫，包括標本材料（組織、血液、尿液、唾液、腦脊液和大便等）、標本采集人信息（年齡、姓名、性別、疾病和采集日期等）以及后續(xù)采集人各種臨床資料（病因、診斷、合并癥、治療方式、影像學資料、檢驗學資料及隨訪信息等），用于疾病診斷、新藥研發(fā)和基礎研究等重要領域[15-16]。目前國內已建立了多個不同種類的腫瘤標本庫[17-19]，但PH的標本庫建立還未見報道，此標本庫的建立有助于為PH基礎與臨床提供實驗保障，為PH早期診斷和無創(chuàng)監(jiān)測方面的研究奠定基礎。邢臺市人民醫(yī)院依托門脈高壓研究中心和中心實驗室的臨床資源和技術優(yōu)勢，探索并成功建立PH生物樣本庫，并通過了相關質量控制，現(xiàn)總結報道如下。

1 材料和方法

1.1 生物標本入庫管理

1.1.1 標本來源：PH標本源自2018 年10 月至2020年6 月就診于本醫(yī)院的患者，納入標準：（1）年齡：18～75歲；（2）診斷為PH（臨床或病理診斷）；（3）簽署知情同意書。排除標準（符合以下任何標準之一）：（1）人體免疫缺損病毒及梅毒陽性者；（2）研究者認為不適于參與的任何醫(yī)學或非醫(yī)學狀況。

1.1.2 儀器設備：超低溫冰箱（海爾冰箱DW-86L490J），超低溫冰箱（中科美菱DW-HL100），生物安全柜（Thermo1389 SERIES A2），液氮罐（東亞YDS-35-125），離心機（Thermo Multifuge X3），電動移液器，手動移液器。

1.1.3 標本收集

（1）血漿、血清標本的處理及保存：血液標本由專職科研護士采集，采用無添加劑的無菌采血管和添加EDTA抗凝劑的無菌采血管各抽血3 mL，樣本采集后盡快以1 500 g/min離心10 min[20]，取血漿和血清各約1.5 mL，分別分裝為3管，每管0.5 mL左右。每個凍存管管壁上分三行，寫“樣本編號、患者姓名、采樣日期”三個信息，管蓋上寫“編號-標本類型。置凍存盒中放-80 ℃冰箱保存，避免反復凍融[21-22]。樣本分裝后原樣本采集管即刻按醫(yī)院醫(yī)療廢棄物處理流程處理。

（2）尿液標本的處理及保存：發(fā)放一次性手套、尿杯和無菌采集管給患者，并告知患者尿液采集要點：排前段尿液，收集中段尿液約半管左右，擰緊蓋子避免污染。收到尿液樣本后立即分裝為3 管并做標記，每管約1 mL。后續(xù)處理同前述“血漿、血清標本的處理及保存”。

（3）唾液標本的處理及保存：發(fā)放無菌采集管給患者，并告知患者唾液采集要點：隨機時間點，漱5口水，每口漱超過10 s，蓄唾液10 s后，吐入無菌采集管，收集3 mL左右，擰緊痰杯蓋子避免污染。工作人員收到唾液標本后立即分裝為3管，每管1 mL。后續(xù)處理同前述“血漿、血清標本的處理及保存”。

（4）組織標本的處理及保存：符合納入標準的患者，如果進行手術或穿刺活檢，在不影響病理診斷取材的前提下收集組織標本。標本離體后30 min內，取肝臟或脾臟等組織（盡量沖盡血液），將標本切成小塊（0.5 cm×0.5 cm，厚度＜0.5 cm）[14]。（1）新鮮保存的標本：將切好的標本放入凍存管，標記好后，迅速放入液氮快速冷凍，15 min后轉入-80 ℃冰箱保存，避免反復凍融；（2）福爾馬林保存的標本：將切好的標本放入裝有福爾馬林的管中，做好標記，常溫保存。

1.2 生物標本庫的管理

1.2.1 生物標本庫臨床數據采集及維護

（1）臨床數據完整準確：與醫(yī)院病理管理系統(tǒng)定制化對接，采集PH患者的臨床信息，包括年齡、性別、體質數、門脈高壓病因、體格檢查結果、實驗室指標、門脈系統(tǒng)解剖學資料（門脈直徑、肝內分支情況、有無血栓、脾靜脈及腸系膜上下靜脈匯合情況等）、門脈血流動力學指標（門靜脈流速、脾靜脈、腸系膜上靜脈流速、胃冠狀靜脈血流方向等）、肝脾彈性結果、胃鏡結果、病理結果、治療方案、治療結果等，及時留存患者影像學圖像（DICOM格式）。

（2）臨床數據及時更新：入庫患者如再次就診，應及時更新患者最新臨床數據資料，并由專人定期隨訪患者，補充患者預后及并發(fā)癥信息。

1.2.2 生物標本的質控：根據PH標本留存的研究目的，對新入庫的標本進行核酸、蛋白質、激素或微生物的質檢，出具檢測報告。放入標本庫未使用的標本每一年進行一次質檢，與最初的質檢報告進行對比，評估標本的質量[21-22]。

1.2.3 生物標本的信息化管理：PH標本庫管理采用海爾公司的標本庫冷鏈智能系統(tǒng)。

（1）空間管理有序、準確、自動化：實現(xiàn)樣本信息查詢、定位、數據批量導入和導出等，提高了空間利用率，確保取樣的準確性。

（2）智能化監(jiān)管：溫濕度自動監(jiān)測并與手機鏈接隨時隨地查看。

（3）保障數據安全和個人隱私：完善的權限管理功能和操作記錄功能，專人專管。

1.2.4 標本的銷毀：標本庫存放的標本存放時間超過一年，經過質檢評估不能使用的標本，需嚴格按照醫(yī)療廢物的流程進行處置，并做好交接和登記[19]。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Excel 2007 軟件對數據進行收集整理，采用SPSS 21.0 進行統(tǒng)計分析。對血清樣本保存前后DNA提取擴增結果進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，血清樣本保存前后DNA提取擴增結果為非正態(tài)分布計量資料，比較采用配對秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 標本收集情況

截至2020年6月共收集標本1 121份，其中組織標本13份，外周血標本434份，尿液標本337份，唾液標本337份。外周血標本中收集血清223份，血漿211份。所收集對象年齡為18～75歲，中位年齡50.6歲，其中男性301例（65.5%）。

2.2 質量控制

隨機選擇標本庫內為乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）所致門脈高壓（HBV-PH）的患者，采集其入庫時HBV-DNA擴增結果。從現(xiàn)有的血清樣本庫中，抽取保存期一年的HBV-PH患者入庫時HBVDNA擴增結果為陽性的38份標本，檢測其血清標本HBV-DNA有無降解。依據DNA提取和擴增試劑盒說明書提取和擴增血清標本的HBV-DNA，樣本擴增均做了3 次重復，采用配對秩和檢驗對標本保存前后HBV-DNA擴增結果進行分析，標本保存前后無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（見表1），表明標本存放一年后仍可滿足后續(xù)實驗要求。

表1 凍存一年前后乙肝標本DNA提取擴增結果分析

3 討論

PH是肝硬化患者的最重要并發(fā)癥之一，全球每年因肝病死亡的人數約有200 萬[7]。PH是肝臟血流動力學改變導致的疾病，是慢性肝病進展和死亡的重要危險因素之一。肝硬化門靜脈高壓患者在腹部外科手術中病死率更高，肝細胞癌合并PH患者的預后極差，因此控制門靜脈高壓可有效降低病死率[23]。有研究者通過收集血清標本，檢測標志物發(fā)現(xiàn)在肝硬化食管靜脈曲張但無出血史的患者中，TGF-β1與HVPG呈負相關[24]。因此，PH的早期發(fā)現(xiàn)和治療成為研究的熱點，科研機構對PH標本的需求也越來越多。

PH標本庫是支撐門靜脈高壓科學研究發(fā)展的有力保障，是促進轉化醫(yī)學研究的關鍵，能夠促進門靜脈高壓醫(yī)學研究的發(fā)展并創(chuàng)造社會和經濟效益，為人類的健康發(fā)展做出貢獻。此標本庫建立的優(yōu)勢如下：（1）能夠促進PH病因學的研究；（2）是篩選新的標志物，找到新的治療手段和方法等轉化醫(yī)學的基石；（3）能夠推動門靜脈高壓研究產業(yè)化[25]。通過1年多的努力，目前此樣本庫已成功留存了門靜脈高壓血液標本434份，組織標本13份，尿液標本337份，唾液標本337 份。同時，定期每6 個月對血液（血清和血漿）標本、組織標本、尿液標本和唾液標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)標本保存質量良好，能夠滿足后續(xù)實驗要求。此外，我們應用海爾公司標準版智能信息系統(tǒng)管理標本庫，每例標本均有相對應的完整臨床病歷資料和隨訪資料。

PH無創(chuàng)診斷方面的研究一直是肝病領域的研究熱點及難點，大多研究都是單中心的，而多中心、大樣本的研究則需建立一個標準、規(guī)范的標本庫。門靜脈高壓標本庫的質量控制是標本庫管理的關鍵，為科研提供合格標本的保障。本中心標本庫通過1 年多的運行經驗總結，標本庫管理應注意以下幾點：（1）標本的收集：標本的留存必須由經過培訓的專人負責，嚴格遵循標本入庫規(guī)范，尿液、唾液、血液和組織標本離體后應迅速處理，組織放置于液氮保存，時間不超過20 min，盡可能避免標本內核酸、蛋白質的降解及微生物狀態(tài)的改變[26]。（2）標本庫的日常維護：制定嚴格的標本庫管理及操作規(guī)范，定期檢測標本庫的冷鏈系統(tǒng)及裝置，保證器械設備溫控及監(jiān)控報警完好，避免標本反復凍融。（3）標本質控：定期隨機抽取各類標本，檢測標本中DNA和RNA的完整性，驗證標本是否可用，保證標本能夠滿足科研要求，對于不能使用的標本，需嚴格按照醫(yī)療廢物的流程進行處置?？傊?，PH嚴重威脅人類的健康和生命，加強對PH基礎及臨床方面的研究十分必要，因此建立多中心甚至全國范圍內統(tǒng)一操作和質控標準的門靜脈高壓標本庫意義重大，能夠收集大量的臨床標本和資料，用于核酸、蛋白質、微生物等生物標志物等的研究，實現(xiàn)PH早期診斷和無創(chuàng)診斷。

綜上所述，我院初步建立了PH生物樣本庫，并進行了標準化的質量控制。后續(xù)，我院將繼續(xù)開展更多種類PH標本的收集和質控，便于深入研究PH發(fā)生發(fā)展機制，為開發(fā)新的PH診斷方法和治療方式提供保障。