赫 曼 杜 杰 楊 磊 李 斌 楊 毅 徐 時(shí) 柴 琛

膿毒癥(sepsis)是宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙，盡管國內(nèi)外已經(jīng)對膿毒癥的病理生理學(xué)有了深入的研究，但目前仍沒有十分有效的治療方法，在發(fā)達(dá)國家每年約有530萬例膿毒癥死亡[1,2]。膿毒癥可引起低血壓休克，中樞的頭端延髓腹外側(cè)區(qū)(RVLM)是調(diào)控中樞心血管活動的關(guān)鍵部位，位于RVLM的前交感神經(jīng)元產(chǎn)生交感沖動，最終決定心輸出量和血管阻力[3]。有研究表明鳶尾素在外周有調(diào)節(jié)血壓作用，但膿毒癥時(shí)鳶尾素在中樞RVLM的作用未見報(bào)道[4]。本研究通過免疫組織化學(xué)檢測鳶尾素在膿毒癥大鼠RVLM中表達(dá)的水平，并在中樞RVLM區(qū)域微量注射鳶尾素，以觀察其對心血管效應(yīng)的調(diào)控，探討鳶尾素是否通過RVLM參與膿毒癥的病程，為臨床防治膿毒癥尋找新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器:鳶尾素購自德國Phoenix Pharmaceuticals公司；兔抗大鼠鳶尾素多克隆抗體購自英國Abcam公司；RM6250型生物信號記錄系統(tǒng)購自成都儀器廠；XTL-3500型解剖顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；大鼠腦MP-805型立體定位儀同購自深圳沃瑞德科技有限公司；小動物DW-3000型呼吸機(jī)購自上海嘉鵬科技有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)動物及分組：清潔級成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(甘)2017-0001]。實(shí)驗(yàn)分為兩部分，每部分均采用數(shù)字表法隨機(jī)進(jìn)行分組。(1)鳶尾素在膿毒癥大鼠RVLM的表達(dá)水平：共15只雄性SD大鼠分為正常對照組、假手術(shù)組和膿毒癥模型組，每組5只。(2)鳶尾素在膿毒癥大鼠RVLM產(chǎn)生的心血管效應(yīng)：造模成功的28只雄性膿毒癥SD大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組7只，對照組RVLM預(yù)先給予注射人工腦脊液；實(shí)驗(yàn)組分別在RVLM注射10、100和1000pmol鳶尾素，觀察并記錄鳶尾素在RVLM產(chǎn)生的心血管效應(yīng)。藥物劑量參考有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5,6]。

3.建立膿毒癥大鼠模型：適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠5天，室溫條件下自由進(jìn)食水，晝夜交替。術(shù)前禁食12h，飲水不限，參照筆者前期研究[7]以盲腸結(jié)扎穿刺法(CLP)建立大鼠膿毒癥模型。2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，取腹部正中1.5cm的豎行切口，進(jìn)腹后游離盲腸系膜，在盲腸末端中外1/3處絲線結(jié)扎，用16號針頭于結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端橫向貫穿兩次，用手輕輕擠壓盲腸使少量腸內(nèi)容物溢出，還納腸管并分層縫合腹壁切口。假手術(shù)組在開腹后只提出盲腸并翻動，然后關(guān)腹。手術(shù)操作后給予大鼠腹部皮下注射30ml/kg 0.9%NaCl注射液，以補(bǔ)充大鼠術(shù)中體液損失。術(shù)后將大鼠置于25℃的環(huán)境中，并給予充足的飼料和飲水。大鼠膿毒癥模型制作成功的表現(xiàn)為：精神萎靡、豎毛、畏寒、眼角分泌物增多。

4.大鼠腦組織免疫組化：將大鼠腦組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化，用檸檬酸鈉進(jìn)行熱修復(fù)，PBS緩沖液沖洗后以3%的過氧化氫封閉15min，加入正常的山羊血清在室溫孵育，滴加一抗(1∶200)4℃冰箱過夜，37℃水浴箱復(fù)蘇后PBS緩沖液洗滌，滴加二抗后37℃的水浴箱孵育，PBS洗滌，滴加SP試劑盒中辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，水浴箱孵育后DAB顯色(1∶20)，顯微鏡下觀察顯示為棕黃色時(shí)終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水后封片。

5.大鼠中樞核團(tuán)微量注射及定位：將大鼠成功麻醉后行氣管插管，進(jìn)行右側(cè)股靜、動脈插管，動脈連接到壓力換能器以記錄血壓和心率。俯臥位將大鼠頭部固定在腦立體定位儀上，開顱暴露延髓，待大鼠血壓和心率穩(wěn)定后進(jìn)行注射。參考腦立體定位圖譜以大鼠的延髓栓部為零點(diǎn)，向頭端移動2.5～2.9mm，旁開1.6～2.0mm，向下進(jìn)針深度3.0～3.4mm。用玻璃微電極自制三通玻璃微電極灌注鳶尾素100nl，給藥時(shí)間5～10s。RVLM微量注射后，在同一給藥部位注射2%滂胺天藍(lán)染色，將大鼠腦組織切片，對照腦立體定位圖譜驗(yàn)證注射部位(圖1)。以上所有手術(shù)操作方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[8，9]。

圖1 大鼠延髓冠狀切面圖RVLM注射部位定位圖

結(jié) 果

1.鳶尾素在RVLM的表達(dá)水平:免疫組化法檢測在RVLM鳶尾素表達(dá)水平，黃色顆粒為表達(dá)陽性。與正常對照組比較，鳶尾素在膿毒癥組中低表達(dá)(P<0.05)；假手術(shù)組與正常對照組比較表達(dá)相似(圖2)。

圖2 鳶尾素在RVLM的表達(dá)(HE染色，×200)A.正常組；B.假手術(shù)組；C.膿毒癥組；D.與正常對照組比較，*P<0.05

2.鳶尾素在RVLM產(chǎn)生的心血管效應(yīng)：膿毒癥模型大鼠單側(cè)RVLM微量注射人工腦脊液對大鼠的血壓和心率沒有明顯影響(P>0.05)，微量注射鳶尾素(10、100、1000pmol)可產(chǎn)生劑量依賴性加快心率和升高血壓的作用，其中低劑量、中劑量以及高劑量組血壓均顯著升高(P<0.05)，高劑量組心率顯著升高(P<0.05)。鳶尾素在RVLM所產(chǎn)生的心血管效應(yīng)約在給藥后10s后產(chǎn)生，10～30s左右升高至最高點(diǎn)，持續(xù)約120～200s，然后逐漸下降恢復(fù)正常水平(圖3)。

圖3 RVLM單側(cè)微量注射鳶尾素對大鼠血壓和心率的影響A～D.RVLM單側(cè)微量注射人工腦脊液(aCSF)、鳶尾素(10、100、1000pmol)后膿毒癥大鼠的心血管效應(yīng)；E～F.與aCSF組比較，*P<0.05

討 論

近年來，膿毒癥的發(fā)生率和病死率在逐漸增加。國際指南提出了“集束化”的綜合治療方案，但結(jié)果仍不盡人意[10, 11]。若膿毒癥發(fā)展為膿毒性休克在臨床治療困難，病死率極高。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥時(shí)一些小分子物質(zhì)在RVLM起到了調(diào)控心血管的作用[9, 12]。RVLM主要接受來自外周多種感受器信息傳入，以及中樞孤束核 (NTS)等心血管調(diào)節(jié)相關(guān)核團(tuán)的信息傳入，并將整合后的信息傳至交感節(jié)前神經(jīng)元，從而在維持交感靜息張力，在調(diào)節(jié)各種心血管反射活動中發(fā)揮作用[13]。

鳶尾素是近年來發(fā)現(xiàn)的由運(yùn)動誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種肌肉因子。在過氧化物酶增殖受體γ激活因子-1α(PCG-1α)調(diào)控下，Ⅲ型纖連蛋白組件蛋白5(FNDC5)基因轉(zhuǎn)錄激活，F(xiàn)NDC5經(jīng)剪切、修飾、分泌后入血，形成的多肽片段為鳶尾素[14]。鳶尾素最初被發(fā)現(xiàn)是一種肌動蛋白，對糖尿病、病理性肥胖等代謝性疾病具有保護(hù)作用，近年來還發(fā)現(xiàn)具有抗炎和抗氧化等作用[15，16]。鳶尾素有望成為炎性疾病診斷的生物學(xué)標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)，具有廣闊的研究前景。

本研究結(jié)果表明，膿毒癥大鼠RVLM中鳶尾素的表達(dá)顯著降低，這提示內(nèi)源性鳶尾素可能參與了膿毒癥的病理過程。鳶尾素在膿毒癥大鼠中樞部位的表達(dá)變化尚未見報(bào)道，但有研究者發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓模型大鼠中樞微量注射鳶尾素可以顯著增加下丘腦神經(jīng)元的c-Fos蛋白表達(dá)，表明中樞鳶尾素水平與大鼠心血管活動相關(guān)[5]。

為進(jìn)一步探討鳶尾素是否為膿毒癥低血壓的始動因素，本研究以不同濃度的鳶尾素進(jìn)行了RVLM微量注射，結(jié)果表明膿毒癥模型大鼠單側(cè)RVLM微量注射人工腦脊液對大鼠的血壓和心率沒有明顯影響(P>0.05)；微量注射鳶尾素(10、100、1000pmol)可產(chǎn)生劑量依賴性加快心率和升高血壓的作用，鳶尾素在RVLM所產(chǎn)生的心血管效應(yīng)約在給藥后10s后產(chǎn)生，10～30s左右升高至最高點(diǎn)，持續(xù)約120～200s，然后逐漸下降恢復(fù)正常水平。這表明鳶尾素在膿毒癥早期可能參與了膿毒性休克的血壓下降過程。有研究顯示，大鼠第三腦室微量注射鳶尾素可以顯著升高血壓，而對原發(fā)性高血壓大鼠靜脈給予鳶尾素時(shí)則產(chǎn)生與之相反的降壓作用，提示鳶尾素可能通過激活下丘腦神經(jīng)元來生產(chǎn)血管加壓素，從而達(dá)到升高血壓的效果[5]。有研究表明鳶尾素通過AMPK-Akt-eNOS-NO信號通路在外周顯示出降壓效果，然而鳶尾素在中樞產(chǎn)生升壓作用的機(jī)制尚未見相關(guān)報(bào)道[17]。本課題組將進(jìn)一步研究鳶尾素在膿毒癥大鼠中樞RVLM調(diào)控心血管活動的作用機(jī)制。