范文秀 馬思晨 張亞潔 朱繡玉 閆洪超

卵巢上皮性癌(卵巢癌)，是最常見的婦科惡性腫瘤之一，盡管目前的外科手術和聯(lián)合化療治療手段趨向于成熟，但由于卵巢癌臨床表現(xiàn)隱匿，前哨癥狀少，疼痛輕微，約25%的卵巢癌病例早期以占優(yōu)勢的腫塊出現(xiàn)，大多情況下患者觸及包塊伴明顯的腹脹就診時多已晚期[1]。加之其容易發(fā)生化療耐藥和復發(fā)轉移，晚期患者的5年生存率僅為30%，相比之下，早發(fā)現(xiàn)、早治療的患者，其5年生存率則提高到92%[2，3]。因此，早期干預是改善卵巢癌患者不良預后的重要策略,故亟需更多的研究來確定新的生物學標志物和治療靶點，使得卵巢癌患者擁有良好結局。

近年來，有研究顯示各種類型的惡性腫瘤發(fā)生均與miRNA的失調有關，miR-214-3P也是研究熱點，作為重要分子樞紐參與腫瘤網(wǎng)絡調控[4]。大多數(shù)情況下miR-214-3P下調，在宮頸癌、結直腸癌子宮內膜癌等腫瘤中表達降低，發(fā)揮抑癌基因作用，相反，在惡性黑色素瘤、胰腺癌、膀胱癌高表達，發(fā)揮癌基因作用[5～10]。因此miR-214-3P極有可能成為潛在的診斷及預后生物學標志物和治療干預的靶點。本研究擬觀察卵巢組織中miR-214-3P的表達水平，通過轉染miR-214-3P-inhibitor質粒至卵巢癌A2780細胞中，探究其對卵巢癌細胞的生物學行為的影響，尋找其對卵巢癌的臨床診治是否具有指導意義，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

1.實驗樣本:組織樣本取自徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2018年10月～2020年6月行手術切除，術前均未進行放療和化療，術后病理確診為卵巢上皮性癌組織40例，同期取得良性卵巢腫瘤組織、正常卵巢組織各30例，經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會同意，患者均簽署知情同意書。各樣本提取后立即放入液氮罐，送入實驗室，進行相應處理。

2.實驗材料：人卵巢癌細胞株A2780復蘇于徐州醫(yī)科大學細胞與分子公共實驗室，DMEM不完全培養(yǎng)基購自南京凱基生物有限公司，四季青胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司，LiPo2000、Trizol試劑購自上海拜力生物有限公司。miR-214-3P-down質粒購自上海吉凱基因化學技術有限公司。miR-214-3P引物購自上海生工生物工程有限公司。反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自美國諾唯贊生物科技有限公司。細胞增殖及毒性檢測試劑盒(CCK-8)購自大連美侖生物技術有限公司。引物序列：反轉錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACA-CTGCC-3′；miRNA-214-3P正向引物：GCGACAGCAGGCACAGACA，miRNA-214-3P反向引物：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT；U6 snRNA正向引物：CGCTTCGGCAGCACATATAC，U6 snRNA反向引物：TTCACGAATTTGCGTGTCATC。

3.實驗方法:(1)實時熒光定量PCR(qPCR)檢測卵巢癌組織中miR-214-3P的表達：按照Trizol試劑說明書，提取各卵巢組織中的總RNA，利用反轉錄試劑盒進行反轉錄，合成cDNA后進行實時定量PCR擴增，獲得各組織的Ct值，以U6作為內參校正誤差。反應條件：95℃預變性5min，然后95℃變性10s,60℃退火30s，共循環(huán)40次。運用2-△△Ct相對定量法來計算目的基因miR-214-3P的相對表達量。(2)細胞培養(yǎng)：復蘇凍存于徐州醫(yī)科大學細胞與分子公共實驗室的人卵巢癌上皮細胞A2780，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于37℃、5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育細胞至細胞融合90%左右進行傳代，傳代至2～5代進行實驗。(3)細胞轉染：將處于對數(shù)生長期的A2780細胞消化，以5×105個/孔密度的細胞懸液均勻接種于6孔板，置于37℃、5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將細胞分為miR-214-3P抑制組、陰性對照組、正常組，各組設兩個復孔，培養(yǎng)24h后，按照LIPO2000轉染試劑進行轉染，轉染后5h換液，轉染24～48h內同實驗方法中實時熒光定量PCR檢測卵巢癌組織中miR-214-3P的表達法提取各細胞組的總RNA進行實時熒光定量PCR，驗證轉染效果。(4)CCK-8法檢測細胞的增殖情況：收集各組已轉染處于對數(shù)生長期細胞，以104個/孔密度的細胞懸液均勻接種于96孔板，每組細胞設4個副孔，置于37℃、5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0、12、24、36、48h后，分別取各階段的細胞，每孔加入10μl的CCK-8，放恒溫培養(yǎng)箱孵育2h，利用酶標儀測定各孔在450nm波長處的吸光度(A)。(5)Transwell小室檢測細胞的遷移和侵襲情況：收集各組已轉染處于對數(shù)生長期細胞，以2×105個/孔密度的細胞懸液接種于上室，下室中加入600μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設2個副孔，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出小室，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色,高倍顯微鏡下隨機計數(shù)5個單獨視野的細胞數(shù)量，取平均值進行統(tǒng)計分析。檢測細胞侵襲能力實驗與上述過程相同，除了Transwell上室預先使用Matrige基質膠(1∶8稀釋)包被。

結 果

1.miR-214-3P在卵巢癌中的表達及相關性分析:卵巢癌組織、良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織的miR-214-3P表達水平分別是5.18±1.91、2.03±0.48和1.41±0.24，卵巢癌組織miR-214-3P表達水平較良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織明顯升高(P<0.05)，良性卵巢腫瘤組織與正常的卵巢組織比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1)；其中40例卵巢上皮性癌中，miR-214-3P的表達水平與FIGO分期、分化程度以及有無淋巴轉移相關(P<0.05)，而與年齡、病理類型無顯著的相關性(P>0.05，表1)。

圖1 miR-214-3P在各卵巢組織中表達水平

表1 miR-214-3P表達水平與卵巢上皮性癌臨床病理關系的分析

2.實時熒光定量PCR檢測卵巢癌細胞中miR-214-3P的表達水平：正常組、陰性對照組和抑制組的miR-214-3P表達水平分別是1、0.875±0.630和0.396±0.931，抑制組miR-214-3P表達水平較正常組和陰性對照組降低(P<0.05)，正常組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2)。

圖2 miR-214-3P在各卵巢細胞中表達水平

3.CCK-8法檢測細胞增殖情況：與正常組和陰性對照組比較，抑制組細胞在0h時，A值比較差異無統(tǒng)計學意義(F=1.528，P=0.256),在培養(yǎng)12、24、36、48h的A值降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=7.507、10.279、23.323、29.464，P均<0.05)；正常組和陰性對照組在培養(yǎng)0、12、24、36、48h的A值，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3)。

圖3 CCK-8法檢測各組細胞的增殖情況與抑制組比較，*P<0.05

4.Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力:與正常組和陰性對照組比較，抑制組細胞發(fā)生遷移和侵襲的細胞數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學意義(F=22.606、40.382，P均<0.05)，正常組和陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4、圖5)。

圖4 轉染miR-214-3P-抑制質粒后各組A2780細胞遷移數(shù)目變化(結晶紫染色，×200)A.正常組；B.陰性對照組；C.抑制組

圖5 轉染miR-214-3P-抑制質粒后各組A2780細胞侵襲數(shù)目變化(結晶紫染色，×200)A.正常組；B.陰性對照組；C.抑制組

討 論

MicroRNA是一組短鏈、非編碼單鏈RNA，調節(jié)多種細胞的分化、增殖和凋亡，直接靶向mRNA的非翻譯區(qū)(UTR)，并成為新的轉錄后調節(jié)因子，起著抑癌基因或啟動子作用[11]。而其中miR-214-3P通過協(xié)調基本信號網(wǎng)絡如PTEN/AKT、β-catrnin和酪氨酸激酶受體途徑，起到關鍵樞紐的作用。同時，miR-214-3P還調節(jié)了關鍵基因表達調控因子的水平，如表觀抑制因子Ezh2、“基因組管家”p53、轉錄因子TFAP2等[12]。因此，miR-214-3P在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

目前，臨床常用檢測血CA125聯(lián)合經(jīng)陰道彩超作為早期卵巢癌篩查手段，敏感度低,只有血CA125等腫瘤指標大幅度升高，并在放射磁共振成像顯示腹內腫塊、腹腔積液、胸腔積液后，才能懷疑診斷[13，14]。通過彩超定位下腫塊穿刺活檢或腹腔鏡探查取樣活檢才得以確診。因此，卵巢癌早期篩查手段和診斷方法還具有一定的局限性。miR-214-3P是近年來研究的一個熱點，在眾多腫瘤中都處于失調狀態(tài)，在乳腺癌中表達降低起到抑癌基因的作用，而在胰腺癌等中高表達發(fā)揮促癌作用[9，15]。本研究中miR-214-3P在卵巢癌組織中表達水平高于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織，而正常組織與良性腫瘤組織間比較差異無統(tǒng)計學意義。

既往有研究表明，miRNAs不僅在組織中表達，在血液中也是穩(wěn)定和可復制的，它們被結合在脂質或脂蛋白復合體中，如外泌體，保護它們不被內源性RNase降解。癌癥患者血液中miRNAs的存在增加了miRNAs作為一種新的診斷標志物的可能性。有研究報道，血清miR-21水平與彌漫性大B細胞淋巴瘤患者的無進展生存期相關[16]。有研究發(fā)現(xiàn)血清miR21在乳腺癌診斷中比其他傳統(tǒng)癌癥標志物顯示出更高的敏感度[17]。由于檢測血液中miRNAs是非侵入性的檢查，不需要對腫塊進行活檢，而miR-214-3P又在卵巢癌中高表達，因此，對卵巢癌患者循環(huán)中外泌體miR-214-3P的檢測,聯(lián)合檢測CA125及HE4,具有成為卵巢癌早期篩選工具的潛力。不過在繞過活檢之前需要進行驗證研究，運用至臨床尚需要一段時間。另外，本研究還分析了miR-214-3P表達與臨床病理特征的關系，臨床期別越高，病理分化越差和已發(fā)生淋巴結轉移的患者，miR-214-3P表達水平越高，而與年齡和病理類型無關，說明其與腫瘤的惡性程度密切相關，可以作為初步評價卵巢癌患者預后的一個指標。

為了更進一步驗證miR-214-3P對卵巢癌細胞的生物學行為的影響，本研究通過體外細胞實驗，采用脂質體轉染的方法，以卵巢癌A2780細胞為研究對象，轉染miR-214-3P抑制表達質粒。研究結果顯示，轉染抑制質粒后抑制A2780增殖，遷移和侵襲能力減弱，這與Yang等[18]研究結論相一致，表明miR-214-3P對卵巢癌細胞系的生物學行為起一定的促進作用。同時Wang等[19]通過慢病毒轉染方法，上調miR-214-3P的表達，再次驗證mir-214-3P在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因作用。另一方面，腫瘤的生長和腫瘤轉移的進展在很大程度上取決于血管生成。

目前大量研究表明，在腫瘤血管生成過程中，miRNAs可以通過非細胞自主和細胞自主的方式調節(jié)內皮細胞的功能，巧妙地控制著“血管生成開關”。有研究顯示，miR-214-3P通過抑制編碼內源性血管生成抑制因子的基因來積極調節(jié)腫瘤血管生成，促進腫瘤血管內皮細胞的增殖和遷移。鑒于miRNAs在腫瘤血管生成中的重要調節(jié)作用，靶向或向腫瘤遞送miRNAs作為一種新的治療方法具有很大的前景。另外，癌癥在一定程度上是一種表觀遺傳疾病，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與表觀遺傳修飾紊亂密切相關，且具有癌基因作用或抑癌基因作用的miRNAs主要受DNA甲基化調控[20]。因此，雖然靶向miR-214-3P治療不會增加以其為抑癌基因的一類腫瘤的發(fā)生可能，但是對于已經(jīng)罹患惡性腫瘤患者，miR-214-3P的表達水平的改變極有可能促進其發(fā)生、發(fā)展。故靶向mir-214-3P治療卵巢癌的同時，必須先行評估患者有無罹患其他惡性腫瘤，或者是否暴露于罹患其他惡性腫瘤的高危環(huán)境中，做到權衡利弊，開展個體化治療。

綜上所述，miR-214-3P在卵巢癌中發(fā)揮一定的促進作用，抑制其表達可減緩腫瘤的進展。盡管現(xiàn)有的檢測技術尚未成熟，但在不遠的將來，miR-214-3P有望成為卵巢癌早期診斷、治療和判斷預后的新靶點。