楊 陽 楊曉敏 胡秀華 曹 簡郭血驕 楊向竹 郭 健 趙俊云

失眠是眾多睡眠障礙中最為常見的一種，主要表現(xiàn)為入睡難、清醒早、睡眠質(zhì)量低和睡眠時間短等特點。長時間的失眠狀態(tài)將導(dǎo)致嚴重的后果，如記憶力或注意力的下降、各種慢性疾病或精神疾病，包括阿爾茨海默病、衰老等[1]。對氯苯丙氨酸(para-Chlorophenylalanine, PCPA)是經(jīng)典失眠動物模型的誘導(dǎo)因素。PCPA可以通過抑制色氨酸羥化酶以阻礙5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)的合成進而導(dǎo)致失眠，目前對PCPA致失眠的機制研究也多集中在5-HT方面。失眠與多種因素有關(guān)，其中控制晝夜節(jié)律的生物鐘系統(tǒng)起著主導(dǎo)作用。生物鐘系統(tǒng)包括位于下丘腦的主鐘以及外周各器官的外周時鐘，其中主鐘于視交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)產(chǎn)生節(jié)律信號并通過神經(jīng)和體液的方式送往全身。機體的自主性節(jié)律主要是由時鐘基因Clock、Bmal1、Per和Cry基因通過負反饋調(diào)節(jié)所形成的。肝臟是涉及糖代謝和脂代謝，并與時鐘基因聯(lián)系緊密的重要子鐘器官之一，其功能的發(fā)揮受到主鐘和外周時鐘的精密調(diào)控。本研究采用經(jīng)典失眠動物模型(PCPA致失眠大鼠)，探究PCPA致失眠大鼠中腦部和肝臟時鐘基因的表達變化，進一步探討失眠與時鐘基因表達變化的關(guān)系。

材料與方法

1.材料：16只SPF級雄性SD大鼠，年齡6～8周，體質(zhì)量200±20g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號為SCXK(京)2015-0015。其他主要材料：PCPA(美國Ark PharmLnc.公司，批號：AK-80383，純度>98%)，Trizol(美國Invitrogen公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP(10mmol/L)、2(Ex TaqMix[寶生物工程(大連)有限公司]，DNase Ⅰ、RNase Inhibitor、6×Loading Buffer[美國Fermentas(MBI)公司]，引物(北京中美泰和生物技術(shù)有限公司)，ELISA檢測試劑盒(北京奇松生物科技有限公司)。實驗儀器：大鼠曠場實驗箱，Safire2酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)，3K15高速冷凍離心機(美國Eppendorf公司)，S-18KS手持電動微量組織勻漿機(萊普特公司)，2720型PCR儀(美國ABI公司)，Roche LightCycler?480II 實時熒光定量PCR系統(tǒng)(德國Roche公司)。

2.方法：(1)模型動物的喂養(yǎng)：適應(yīng)性喂養(yǎng)16只SD雄性大鼠，1周后將其隨機分為對照組(8只)和模型組(8只)，模型組一次性腹腔注射PCPA300mg/kg，對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，飼養(yǎng)過程中采取正常環(huán)境光照，給予大鼠正常飲食。(2)曠場實驗：實驗第3天進行曠場實驗。曠場實驗箱體積為100cm×100cm×45cm，將大鼠輕輕放在曠場正中格，系統(tǒng)自動記錄大鼠3min內(nèi)行為的垂直得分(穿過地面方塊的數(shù)量)與水平得分(前爪騰空或攀附動作的次數(shù))，以大鼠活動的總路程(垂直得分與水平得分之和)作為本實驗的檢測指標(biāo)。在每次實驗結(jié)束后，將動物糞便清除并擦拭實驗箱底部及內(nèi)壁，75%乙醇擦拭消毒，乙醇揮發(fā)無味后進行下一次操作。實驗期間保持安靜，周圍參照物不變，實驗者不變。(3)ELISA法檢測HPA軸激素水平：實驗第3天，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。腹主動脈采血，4℃下靜置1h；3500r/min離心15min，收集血清，按照ELISA試劑盒說明書進行檢測。(4)RT-qPCR檢測時鐘基因轉(zhuǎn)錄水平：采血后，從大腦皮層和肝右葉靠近門靜脈處取樣，勻漿處理。從對照組和模型組中各取3只大鼠的腦、肝臟勻漿樣品，每個樣品進行1次RT-qPCR試驗。采用Trizol法提取腦部、肝臟mRNA，RNA瓊脂糖凝膠電泳觀察其濃度和純度。將RNA提取物反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR反應(yīng)條件為95℃ 5min預(yù)變性后，95℃ 15s，62℃ 30s(熒光檢測)，45個循環(huán)。引物序列詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

結(jié) 果

1.自主活動：與對照組比較，模型組大鼠行為學(xué)得分(大鼠3min內(nèi)活動的總路程，即穿過地面方塊的格數(shù)與前爪騰空或攀附動作的次數(shù)之和)顯著升高(P<0.01)，詳見表2。

表2 PCPA對失眠大鼠曠場行為學(xué)得分和HPA軸血清水平的影響

2.HPA軸激素水平變化：兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表2。

3.腦部時鐘基因轉(zhuǎn)錄水平：與對照組比較，模型組腦部Clock、Bmal1、Cry1的表達顯著下降(P<0.05)；Cry2的表達顯著上升(P<0.05)，Per1、Per2的表達變化不顯著，詳見表3。

表3 PCPA對失眠大鼠腦部時鐘基因表達情況的影響

4.大鼠肝臟時鐘基因轉(zhuǎn)錄水平：與對照組比較，模型組肝臟Clock、Cry2、Bmal1、Per2、Cry1的表達變化不顯著，Per1的表達顯著上升(P<0.01)，詳見表4。對比腦部與肝臟時鐘基因轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)腦部與肝臟的Bmal1、Per1、Cry1、Cry2的變化趨勢一致(Per1、Cry2上升，Bmal1、Cry1下降)；而Clock、Per2的變化趨勢相反，腦部Clock基因表達下降，Per2基因表達上升；肝臟Clock基因表達上升，Per2基因表達下降。

表4 PCPA對失眠大鼠肝臟時鐘基因表達情況的影響

討 論

PCPA在嚙齒類動物致失眠中的作用顯著，操作簡便，被廣泛應(yīng)用于失眠研究中。中樞5-HT水平與睡眠有密切的聯(lián)系，若腦內(nèi)5-HT水平降低，則動物會出現(xiàn)失眠癥狀。5-HT以體內(nèi)的色氨酸為原料進行生物合成。色氨酸羥化酶是5-HT生物合成中的限速酶，而PCPA是色氨酸羥化酶的選擇性抑制劑，PCPA可通過抑制色氨酸羥基化以降低5-HT的合成。研究表明，大鼠腹腔注射PCPA后，大鼠腦中的5-HT水平會逐漸下降，在第3天達到峰值，同時大鼠會表現(xiàn)出晝夜節(jié)律消失、攻擊性增加、活動增加等癥狀[2]。曠場實驗?zāi)軌蛟u價動物活動的主動性，本實驗發(fā)現(xiàn)模型組行為學(xué)得分顯著高于對照組，符合PCPA模型癥狀[3]。

下丘腦中有多種5-HT能纖維，參與HPA軸的調(diào)節(jié)。目前認為HPA軸的過度激活是失眠的生理學(xué)基礎(chǔ)之一，失眠中的生理興奮一部分通過HPA軸的過度激活體現(xiàn)。生理條件下HPA軸通過負反饋調(diào)節(jié)，對維持正常的睡眠-清醒節(jié)律有一定意義[4]。另外，晝夜節(jié)律與HPA軸之間相互作用，糖皮質(zhì)激素可通過與糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件結(jié)合改變生物鐘基因，參與外周時鐘與主鐘的節(jié)律同步調(diào)節(jié)[5]。睡眠時間還和炎性因子、HPA軸的激活和外周皮質(zhì)醇的釋放有一定的關(guān)系[6]。有研究發(fā)現(xiàn),失眠者的ACTH和皮質(zhì)醇水平有一定升高[7]。本實驗中HPA軸的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，基本符合臨床中失眠患者的HPA軸激素變化趨勢[8]。結(jié)合曠場實驗中大鼠興奮性的顯著提升與大鼠HPA軸活躍度的上升，說明PCPA誘導(dǎo)失眠是有效的。

在哺乳動物中，時鐘基因幾乎存在于所有組織和細胞中。在SCN區(qū)的主鐘主要受到來自視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的光-電信號調(diào)節(jié)，而外周時鐘則既受到來自主鐘的調(diào)節(jié)，同時也受到其他諸多外界因素的調(diào)控，如溫度、進食模式、營養(yǎng)條件等。在動物試驗中，當(dāng)SCN被破壞時晝夜節(jié)律完全消失。SCN區(qū)含有約20000個能夠自主調(diào)節(jié)節(jié)律的細胞，通過神經(jīng)調(diào)節(jié)和體液調(diào)節(jié)等方式將節(jié)律信號傳遞到全身各處[9]。SCN區(qū)細胞的自主節(jié)律由時鐘基因調(diào)控，時鐘基因是機體自身調(diào)節(jié)的重要基礎(chǔ)部分之一，與生命的各種活動密切相關(guān)[10]。在生理條件下，時鐘基因在一天中的表達波動通過負反饋調(diào)節(jié)。Clock和Bmal1基因的優(yōu)勢表達導(dǎo)致清醒，Per和Cry基因的優(yōu)勢表達導(dǎo)致睡眠。在11:00～14:00時，Clock和Bmal1基因表達量逐漸升高并產(chǎn)生峰值，從而產(chǎn)生了清醒[11]。Clock和Bmal1基因表達量的升高激活了Per和Cry基因的表達，Per和Cry基因產(chǎn)物能進入細胞核并抑制Clock和Bmal1基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致了睡眠[12]。Per和Cry產(chǎn)物會被自行降解，降解后則又迎來下一輪清醒-睡眠周期。如此交替，形成了晝夜節(jié)律性變化[13]。

本實驗中腦部主鐘的時鐘基因呈現(xiàn)了有規(guī)律性的變化，正向調(diào)控因子Clock基因和Bmal1基因表達下調(diào)，負向調(diào)控因子Per和Cry基因表達上調(diào)。相較于其他造模方式無規(guī)律的時鐘基因變化，PCPA造模法體現(xiàn)出了獨特的意義。然而造成這種規(guī)律的機制還不明確，有待于進一步研究。但是在本實驗大鼠腦部各時鐘基因的規(guī)律性變化中，Cry1基因的表達出現(xiàn)了反常。Cry1的反常表達可能與細胞自噬有一定聯(lián)系?；衔?-PCPA具有促進細胞自噬功能，而PCPA與2-PCPA在結(jié)構(gòu)上相似，提示PCPA可能具有類似2-PCPA的促進細胞自噬作用[14]。

每個器官協(xié)調(diào)主鐘與外周時鐘的機制都有所不同，有時甚至能夠拒絕來自主鐘的調(diào)控。肝臟是涉及糖代謝和脂代謝的重要器官，其功能的發(fā)揮受到主鐘和外周時鐘的精密調(diào)控，故本實驗選擇肝臟作為子鐘器官的代表進行研究。本研究中，肝臟外周時鐘基因變化的規(guī)律性較腦部主鐘的變化規(guī)律性低，正向調(diào)控因子與負向調(diào)控因子均各有升降。除肝臟的Clock、Per2的表達趨勢與腦部不同之外，其他時鐘基因的表達均與腦部時鐘基因的變化趨勢一致。肝臟除了受到時鐘基因的調(diào)控之外，胰島素、生長素、腸源性激素、催產(chǎn)素等，都會對肝臟的時鐘基因產(chǎn)生影響[15]。肝臟的時鐘基因表達還與循環(huán)胰島素水平有關(guān)，當(dāng)給予大鼠高脂飲食時，大鼠的Clock和Bmal1基因表達會出現(xiàn)紊亂。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，PCPA致失眠大鼠的腦部Clock、Bmal1、Cry1基因表達下降，Per1、Per2、Cry2基因表達提高；肝臟Clock、Per1、Cry2的表達上升，Bmal1、Per2、Cry1基因表達下降。本研究中還存在有待于進一步研究的問題，如取材時間、蛋白水平等，后續(xù)工作將進一步闡明失眠動物模型的相關(guān)機制，為失眠研究提供多層次的實驗依據(jù)。