徐玉順 鄭 丹 宋 偉

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是多數(shù)心血管疾病如心肌梗死、心絞痛、心力衰竭的主要致病因素，其主要病理過程是動(dòng)脈內(nèi)膜形成包含脂質(zhì)、細(xì)胞、碎片和瘢痕組織的不穩(wěn)定斑塊[1～3]。平滑肌細(xì)胞(SMA)位于血管內(nèi)側(cè)層，正常生理?xiàng)l件下主要負(fù)責(zé)動(dòng)脈的收縮和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，而在AS過程中，SMA由高表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)的收縮型細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦弑磉_(dá)骨橋蛋白(osteopontin， OPN)的增殖型細(xì)胞，同時(shí)高表達(dá)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen， PCNA)，促進(jìn)細(xì)胞向斑塊內(nèi)增殖遷移，加速斑塊的形成，而其中的分子調(diào)控機(jī)制尚未明確。C型凝集素識(shí)別受體2(Dectin-2)是C型凝集素受體的一員[4]。有研究發(fā)現(xiàn)Dectin-2高表達(dá)于免疫細(xì)胞中，在多種真菌感染的免疫炎性反應(yīng)中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[5]。而髓系缺失Dectin-2并不影響AS的病理進(jìn)程[6]。本研究旨在探究SMA中Dectin-2在AS中的作用及其分子機(jī)制。

材料與方法

1.材料：(1)細(xì)胞株：原代人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(批號(hào)：CC-2571)購(gòu)自美國(guó)LONZA公司。(2)動(dòng)物：6只Apoe-/-小鼠和6只C57BL/6(清潔級(jí)，6～8周齡，體質(zhì)量20～25g，雄鼠)購(gòu)買并飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院[使用許可：SYXK(浙)2019-0011]。飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)，飼養(yǎng)條件：溫度20±2℃，濕度50%±2%，標(biāo)準(zhǔn)光照12h /黑暗12h節(jié)律，自由飲水。C57BL/6采用普通飼料喂養(yǎng)，Apoe-/-采用高脂飼料喂養(yǎng)。(3)主要試劑：氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(批號(hào)：1875610)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；XTDMZYYH-1動(dòng)脈粥樣硬化模型飼料(批號(hào)：11984)購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：6548)購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；Edu細(xì)胞增殖試劑盒(批號(hào)：198421)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一步法RT-PCR試劑盒(批號(hào)：26513)購(gòu)自艾美捷科技有限公司； Dectin-2、α-SMA、OPN、PCNA RT-PCR引物(批號(hào)：516118)均購(gòu)自鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司； p-STAT3兔單抗(批號(hào)：ab1651)、STAT3兔單抗(批號(hào)：ab1664)、p-JAK兔單抗(批號(hào)：ab36565)、JAK兔單抗(批號(hào)：ab81384)、Dectin-2兔單抗(批號(hào)：ab3626)、SMA鼠單抗(批號(hào)：32165)均購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。原代人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基SmGM-2 (批號(hào)：CC-3182) 購(gòu)自美國(guó)LONZA公司。Dectin-2敲降病毒和對(duì)照病毒(批號(hào)：1984)購(gòu)自漢恒生物科技(上海)有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：小鼠分為兩組，即對(duì)照組和動(dòng)脈粥樣硬化組，每組各6只。對(duì)照組C57BL/6小鼠喂食普通飼料，動(dòng)脈粥樣硬化組Apoe-/-小鼠飼喂高糖高脂飼料。4個(gè)月后，取小鼠主動(dòng)脈組織，清除周圍結(jié)締組織后，利用0.9%氯化鈉溶液清洗干凈，取部分組織用于RNA提取，剩余組織利用多聚甲醛固定后制成石蠟切片。

3.斑塊組織Dectin-2免疫熒光染色：將上述兩組小鼠AS斑塊石蠟切片取出后，放于60℃烘箱中烘1h，之后通過二甲苯-乙醇進(jìn)行脫蠟進(jìn)水，利用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，0.5% Triton破膜15 min，利用山羊血清封閉，之后加入一抗孵育過夜(抗體稀釋比：Dectin-2兔單抗1∶200；SMA鼠單抗1∶200)。第2天孵育熒光二抗，最后利用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片，利用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行拍照。

4.細(xì)胞培養(yǎng):原代人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞利用專門的SmGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為兩組，分別為對(duì)照組和敲降組，細(xì)胞鋪板24h后，對(duì)照組加入對(duì)照病毒，敲降組加入Dectin-2敲降病毒。同時(shí)在培養(yǎng)基中加入ox-LDL刺激。48h后檢測(cè)細(xì)胞增殖率或者提取蛋白、RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5.細(xì)胞增殖率檢測(cè):SMA細(xì)胞鋪板于96孔板中24h，經(jīng)上述步驟處理后，按細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明書操作，在每孔中加入細(xì)胞活力檢測(cè)試劑，孵育培養(yǎng)2h后取出，檢測(cè)溶液的吸光度值。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式為：增殖率=(敲降后吸光度值-鋪板24h吸光度值)/鋪板24h吸光度值×100%。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

6.Edu細(xì)胞增殖水平檢測(cè)：將平滑肌細(xì)胞鋪板于細(xì)胞爬片上，經(jīng)上述步驟處理后，按照Edu細(xì)胞增殖試劑盒說明書操作，最后用含DAPI的抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片，利用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行拍照。

7.組織或細(xì)胞中Dectin-2、OPN、PCNA、α-SMA mRNA水平檢測(cè)：取上述小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織，或者上述兩組細(xì)胞后，利用Trizol裂解組織或者細(xì)胞RNA，通過氯仿-異丙醇分離純化出RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，一步法反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 10s；60℃ 50s。計(jì)算各組mRNA相對(duì)表達(dá)量，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

8.細(xì)胞中p-STAT3、STAT3、p-JAK、JAK水平檢測(cè):兩組細(xì)胞經(jīng)上述處理后，提取總蛋白，經(jīng)過BCA法檢測(cè)蛋白濃度，取20μl蛋白進(jìn)行蛋白電泳。經(jīng)過電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉后于4℃孵育一抗過夜，一抗包括p-STAT3兔單抗、STAT3兔單抗、p-JAK兔單抗、JAK兔單抗、內(nèi)參Actin兔單抗。第2天利用TBST洗去未結(jié)合的一抗后室溫孵育辣根過氧化物酶耦連的二抗1h，再次利用TBST洗去未結(jié)合的二抗，利用化學(xué)掃膜儀進(jìn)行掃膜分析。

結(jié) 果

1.小鼠AS斑塊和正常血管中Dectin-2的表達(dá)水平:RT-PCR法結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，動(dòng)脈粥樣硬化組AS斑塊中Dectin-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P=0.000)，同時(shí)斑塊組織切片免疫熒光染色結(jié)果同樣顯示，與對(duì)照組比較，斑塊組織中Dectin-2的表達(dá)明顯上調(diào)(圖1、圖2)。

圖1 小鼠AS斑塊和正常血管中Dectin-2的表達(dá)水平與對(duì)照組比較，*P=0.000

圖2 小鼠AS斑塊和正常血管中Dectin-2、α-SMA表達(dá)免疫熒光，×200

2.敲降Dectin-2對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖率的影響:CCK8結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，敲降組平滑肌細(xì)胞增殖率明顯偏低(P<0.01，圖3、圖4)。

圖3 CCK8檢測(cè)Dectin-2對(duì)平滑肌增殖的影響與對(duì)照組比較，*P<0.01

圖4 Edu檢測(cè)Dectin-2對(duì)平滑肌增殖的影響 免疫熒光，×600綠色熒光信號(hào)為Edu陽性信號(hào)，即為增殖細(xì)胞

3.敲降Dectin-2對(duì)平滑肌細(xì)胞OPN、PCNA、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響:RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，敲降組OPN、PCNA mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，同時(shí)α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.01，圖5)。

圖5 RT-PCR檢測(cè)Dectin-2對(duì)OPN、PCNA、α-SMA的影響與對(duì)照組比較，*P<0.01

4.敲降Dectin-2對(duì)p-STAT3、STAT3、p-JAK、JAK表達(dá)的影響：與對(duì)照組比較，敲降組p-STAT3、p-JAK水平明顯降低(P<0.05)，而總STAT3、JAK水平無明顯變化(圖6)。

圖6 Western blot法檢測(cè)p-STAT3、STAT3、p-JAK、JAK表達(dá)水平

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)Dectin-2在AS斑塊中表達(dá)顯著上調(diào)，抑制Dectin-2表達(dá)可以減少ox-LDL誘導(dǎo)的SMA增殖和表型轉(zhuǎn)化。Dectin-2調(diào)控SMA的增殖和表型轉(zhuǎn)化過程可能是通過促進(jìn)了STAT3信號(hào)活化。

Dectin-2是C型凝集素識(shí)別受體家族成員，其他還包括C型凝集素識(shí)別受體1(Dectin-1)和C型凝集素識(shí)別受體3(Dectin-3)。Dectin-2多肽包含一個(gè)胞外C端C型碳水化合物識(shí)別域(CRD)，該域連接至跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)短N(yùn)端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，在對(duì)真菌和細(xì)菌的天然免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[9]。人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(The Human Protein Atlas)顯示Dectin-2主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞中，而在平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)也是較高的[10]。此前研究發(fā)現(xiàn)髓系缺失Dectin-2小鼠并不影響AS斑塊的形成[6]。然而目前Dectin-2在SMA中的作用尚未報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),Dectin-2在AS斑塊中表達(dá)明顯上調(diào)，提示Dectin-2可能在AS其他的基質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用。

在AS發(fā)生早期，由于內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一氧化氮明顯減少，而生理狀態(tài)下，一氧化氮是維持SMA處于收縮性狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控信號(hào)。一氧化氮的減少導(dǎo)致SMA由高表達(dá)α-SMA的收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楦弑磉_(dá)OPN的增殖型，促進(jìn)SMA向內(nèi)膜層增殖遷移，使得局部形成凸起的斑塊組織。因此探究平滑肌細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)控分子有利于為靶向治療AS提供理論依據(jù)[11]。本研究發(fā)現(xiàn),Dectin-2敲降平滑肌細(xì)胞收縮型標(biāo)志物α-SMA表達(dá)上調(diào)，增殖型標(biāo)志物OPN表達(dá)下調(diào)，抑制SMA發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。同時(shí)平滑肌細(xì)胞在發(fā)生表型轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞增殖相關(guān)調(diào)控蛋白PCNA的表達(dá)明顯上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞快速增殖，形成新生內(nèi)膜[12]。因此筆者也檢測(cè)了SMA細(xì)胞的增殖標(biāo)志物PCNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，Dectin-2敲降能夠明顯抑制PCNA的表達(dá)，Edu增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。

JAK/STAT3信號(hào)是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的關(guān)鍵途徑之一[13]。在各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，包括血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)-BB，血管緊張素Ⅱ或白介素(IL)-6或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)刺激下， SMC中STAT3可發(fā)生磷酸化激活[14]。有研究報(bào)道，STAT3蛋白通過與心肌素相互作用調(diào)節(jié)血管SMA發(fā)生表型轉(zhuǎn)換。表明JAK/STAT3信號(hào)在VEGF誘導(dǎo)的SMA細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的作用。而本研究發(fā)現(xiàn)敲降Dectin-2后JAK/STAT3的磷酸化水平明顯下調(diào)。因此，筆者推測(cè)Dectin-2通過調(diào)控JAK/STAT3的磷酸化活化參與SMA細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控。

綜上所述，探究血管平滑肌細(xì)胞的增殖和表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于研究AS的進(jìn)展有重大意義，本研究發(fā)現(xiàn)Dectin-2在AS斑塊中表達(dá)上調(diào)，對(duì)SMA的增殖和表型轉(zhuǎn)化有重要的調(diào)控作用，有望成為靶向治療AS的重要靶點(diǎn)。