鄧 岱 韓 雪 劉文虎
血管鈣化(vascular calcification, VC)是慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)患者常見的并發(fā)癥之一,尤其是終末期腎臟病患者死亡的重要危險因素[1, 2]。研究發(fā)現(xiàn),CKD患者VC的主要病理改變是血管中膜鈣化,發(fā)病機制涉及鈣磷代謝異常、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)成骨轉分化轉換、鈣化抑制物缺乏等多方面因素[3]。然而目前關于CKD血管鈣化發(fā)生的確切機制尚未完全明確,因此建立一種準確、簡便、穩(wěn)定性好的CKD血管鈣化動物模型對于進一步研究意義重大。在諸多研究CKD血管鈣化的動物模型中,應用腺嘌呤能夠誘導出與臨床高度類似的慢性腎衰竭動物模型,可出現(xiàn)包括動脈中層鈣化等相關并發(fā)癥,但常規(guī)應用0.75%腺嘌呤仍存在許多缺點,VC發(fā)生率及鈣化程度相對較低、嚴重和短期即出現(xiàn)的營養(yǎng)不良、干預4~6周時的高死亡率[4, 5]。因此,需要建立一種能夠提高生存率的同時增加動脈中層鈣化程度的改良腺嘌呤誘導CKD血管鈣化動物模型。本研究建立了改良腺嘌呤(0.3%)飲食喂養(yǎng)的新型慢性腎臟病大鼠模型,探索比常規(guī)腺嘌呤(0.75%)喂養(yǎng)動物模型更廣泛和穩(wěn)定的動脈中層鈣化。
1.材料:(1)實驗動物: SPF級雄性SD大鼠38只,8周齡,體質量300±20g(北京華阜康生物科技股份有限公司),飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院實驗動物中心。實驗取得首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院實驗動物管理委員會的許可。(2)試劑: 對照組:普通飼料飲食,含1.0%鈣、1.2%磷、20%谷物基礎蛋白。模型組:常規(guī)高腺嘌呤飲食,含0.75%腺嘌呤、1.0%鈣、1.8%磷、20%谷物基礎蛋白。改良組:改良低腺嘌呤飲食,0.3%腺嘌呤、1.0%鈣、1.8%磷、20%乳糖、20%酪蛋白基礎蛋白(定制自北京科澳協(xié)力飼料有限公司)。其他試劑:鈣離子檢測試劑盒(美國Bioassay公司),Von Kossa染色試劑盒(上海杰美醫(yī)藥科技有限公司)。
2.動物分組及處理:將大鼠隨機分為對照組 (給予正常飲食)8只、模型組(常規(guī)高腺嘌呤飲食)15只、改良組(改良低腺嘌呤飲食)15只,共8周。
3.標本采集及生存分析:第2、4、6、8周采用斷尾取血法,每只大鼠采血量為2ml,血液置于室溫下自然凝固10~20min,3000r/min離心10min,收集上清液待測。8周時,對各組間進行生存分析比較。對前8周自然死亡和8周時麻醉后處死的大鼠,取出主動脈,分成兩部分,分別用于形態(tài)學、鈣離子測定。
4.生化檢測:使用全自動生化儀(Hitachi 7170)檢測大鼠血清中白蛋白、尿素氮、肌酐、鈣、磷,測定尿蛋白、尿磷、尿鈣。
5.大鼠主動脈鈣含量測定: 取大鼠胸主動脈段,用吸水紙吸干水分至重量不再改變后稱重,置于1mmol/L的鹽酸中37℃消化24h,吸取上清脫鈣液,10000r/min離心10min后收集上清,參照鈣含量測定試劑盒說明書檢測血管組織鈣離子濃度,計算鈣離子含量/血管組織重量。
6.大鼠主動脈Von Kossa染色:以常規(guī)組織取材、包埋、切片方法制備大鼠腹主動脈石蠟切片,按照Von Kossa染色試劑盒說明書操作步驟進行染色。
1.大鼠生存情況:8周時,對照組大鼠未出現(xiàn)死亡;模型組大鼠死亡12只,死亡率80.0%;改良組死亡4只,死亡率26.7%,與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。生存分析(Kaplan-Meier方法)結果顯示改良組大鼠存活率明顯高于模型組,生存時間更長,差異有統(tǒng)計學意義(Log-Rank檢驗,P<0.05,圖1)。
圖1 大鼠生存時間分析
2.大鼠生理和生化指標情況:通過對模型組大鼠前6周及改良組前8周每2周記錄體質量、進食量及血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、白蛋白(ALB)、矯正鈣(Ca)、血磷(P)、尿磷指標分析發(fā)現(xiàn),兩組大鼠與對照組比較均出現(xiàn)BUN、SCr升高;體質量、進食量和ALB水平下降;繼而出現(xiàn)高磷血癥和高磷酸鹽尿(表1)。然而這些指標在改良組的變化更緩慢,6周時改良組大鼠BUN水平低于模型組(P<0.05)、SCr與模型組相近(P>0.05),改良組的血磷水平和尿磷排泄值更高(P<0.05)、ALB水平和體質量更高(P<0.05)。8周時改良組大鼠BUN、SCr水平與模型組大鼠6周時對應指標近似相同,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),同時改良組血磷水平、尿磷排泄值、ALB水平和體質量也更高(P<0.05)。
3.大鼠血管鈣化情況:3組間主動脈鈣含量的情況:改良組大鼠8周時和模型組大鼠6周時的主動脈鈣含量(主動脈濕重每克所含鈣毫克值)顯著高于對照組(P<0.05);改良組與模型組再次比較時,前組鈣含量仍高于后組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2)。對Von Kossa染色的大鼠主動脈進行鈣化程度的半定量分析:病理圖片(圖3)中血管鈣化顯示為染色呈現(xiàn)黑色結節(jié),根據(jù)鈣化面積占血管環(huán)面積的百分比S進行鈣化積分(表2),結果顯示對照組8周時未檢測到血管鈣化灶,改良組8周時鈣化積分高于模型組6周時的鈣化積分,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4)。
表1 模型組及改良組大鼠生理及生化指標變化情況
圖2 大鼠主動脈鈣含量與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05
圖3 大鼠主動脈不同程度的鈣化病理(Von Kossa染色,×40)
CKD患者VC并發(fā)癥發(fā)生率高達30%~80%,是此類患者心血管死亡和全因病死率的重要危險因素[6]。筆者團隊一直致力于探究CKD血管鈣化的發(fā)病機制及防治方法,其中用于研究的CKD血管鈣化動物模型是此類研究的重要基礎。然而既往CKD大
表2 主動脈鈣化定量積分
圖4 大鼠主動脈鈣化程度的半定量分析與模型組比較,*P<0.05
鼠模型出現(xiàn)VC的時間慢,延長了實驗周期,而且隨著腎衰竭進展,容易出現(xiàn)嚴重營養(yǎng)不良及高死亡率影響研究結果。因此,本研究建立了一種高效且穩(wěn)定的CKD大鼠血管鈣化模型。
CKD3期后并發(fā)的礦物質、骨代謝異常啟動了VC的進程[7,8]。關于CKD誘導VC模型的研究,最早是以腺嘌呤飲食誘導出VC和繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進,這也是目前國內外應用較多的基礎模型[9,10]。腺嘌呤進入機體后可通過代謝產(chǎn)物堵塞腎小管、氧化應激等途徑誘導腎損傷的發(fā)生。單純腺嘌呤飲食誘導CKD模型所需時間長約8~12周,且VC發(fā)生率僅15%左右。為了縮短造模時間,提高VC發(fā)生率,后續(xù)研究考慮到高磷血癥在CKD血管鈣化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用,通過促進VSMCs成骨樣分化、誘導VSMCs凋亡、促進基質小泡釋放等途徑導致VC[11]。于是諸多研究對腺嘌呤飲食干預的CKD誘導VC模型進行優(yōu)化,多在腺嘌呤飲食或混懸液灌胃的基礎上聯(lián)合高磷飲食制作CKD血管鈣化動物模型,進而縮短了造模時間,提高鈣化的發(fā)生率[12,13]。然而多項研究發(fā)現(xiàn),標準腺嘌呤飲食(0.75%)聯(lián)合高磷飲食(1.8%)制作的CKD大鼠VC模型約4~5周時開始出現(xiàn)死亡,6周時死亡率明顯增高,且存在嚴重營養(yǎng)不良,少數(shù)大鼠死亡時也未出現(xiàn)VC[14]。因此,本研究探索了一種新型的改良腺嘌呤聯(lián)合高磷飲食誘導CKD大鼠VC的模型,它與傳統(tǒng)腺嘌呤聯(lián)合高磷飲食比較,能夠延緩腎衰竭的進程,出現(xiàn)更廣泛、嚴重的動脈中層鈣化,同時改善CKD大鼠后期營養(yǎng)狀況,延長生存時間,明顯降低死亡率。
在不利用基因操作的條件下,建立慢性腎功能不全大鼠廣泛而顯著的動脈中層鈣化模型具有一定的挑戰(zhàn)性。本研究為了克服傳統(tǒng)腺嘌呤高磷飲食喂養(yǎng)大鼠模型的缺點,制作了一種新的合成飲食,在以下3個方面進行改良與創(chuàng)新:(1)既往研究發(fā)現(xiàn)以0.75%腺嘌呤為基礎的飲食會導致大鼠模型嚴重的腎衰竭和營養(yǎng)不良,進而導致4~6周時的高死亡率。本研究使用僅含0.3%腺嘌呤的飲食減緩了CKD進程,血肌酐、尿素氮水平升高更緩慢,同時動物體質量及血白蛋白下降減慢,避免了迅速的營養(yǎng)不良以及后續(xù)的高死亡率。(2)本研究選擇含酪蛋白飲食作為蛋白質來源,由此促進胃腸道對磷的吸收,通過增加高磷飲食的吸收進一步提升血磷水平,以促進VC的發(fā)生。(3)本研究在飲食中添加了20%的乳糖以進一步增加胃腸道對鈣和磷的吸收。
本研究結果顯示,改良組大鼠的血肌酐、尿素氮水平與模型組相近,但改良組大鼠腎衰竭的進展相對較慢,并且其相同周數(shù)時血磷水平高于模型組。模型組大鼠4周后開始出現(xiàn)死亡,且死亡率逐漸上升,6~8周期間改良組生存率明顯高于模型組。VC形態(tài)學、定量分析顯示,改良組大鼠VC的程度比改良組更重,呈現(xiàn)廣泛而明顯的動脈中層鈣化,而對照組大鼠并未出現(xiàn)VC,說明與周齡增加無相關。本研究發(fā)現(xiàn)該動物模型存在8周時鈣化進一步發(fā)展的可能性?;诒灸P偷囊陨咸攸c,并符合實驗動物的“3R”原則(減少、細化和替換),改良腺嘌呤飲食喂養(yǎng)大鼠模型具有更長生存期和穩(wěn)定VC發(fā)生,可以減少用于VC研究的動物數(shù)量,該模型值得進一步推廣應用。