夏心怡 胡麗麗 殷 峻

低碳飲食是近年來(lái)興起的新飲食方式，提倡減少碳水化合物的凈攝入，每日碳水化合物攝入大都低于總熱量的20%，所需熱量轉(zhuǎn)而由脂肪提供。機(jī)體從基于葡萄糖的能量代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛谥镜哪芰看x。臨床研究發(fā)現(xiàn)，低碳飲食減少葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而改善肥胖[1～6]。對(duì)于糖尿病患者，低碳飲食顯著降低體重，改善空腹血糖及糖化血紅蛋白，減少胰島素的注射劑量，甚至停藥[7～9]。然而，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，60%脂肪的低碳高脂飲食常用于肥胖小鼠的造模，小鼠出現(xiàn)明顯的血糖增高及胰島素抵抗。本實(shí)驗(yàn)旨在探討不同碳水化合物比例的飲食對(duì)小鼠體質(zhì)量及代謝的影響，并與低碳飲食的2型糖尿病患者進(jìn)行初步比較，探究低碳飲食對(duì)小鼠及人產(chǎn)生不同效果的原因。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：3周齡健康SPF級(jí)C57BL/6J野生型雄鼠48只，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物中心。短效人胰島素購(gòu)自丹麥諾和諾德制藥有限公司，葡萄糖購(gòu)自上海生工生物工程公司，丙酮酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,血糖儀及血糖試紙購(gòu)自瑞士Roche公司，血清胰島素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Crystal Chem公司。普食、60%高脂飲食(可可脂)和75%高脂飲食定制于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。60%高脂飲食(豬油)購(gòu)自美國(guó)Research Diets公司。

2.動(dòng)物飼養(yǎng)：動(dòng)物飼養(yǎng)在12h光照/12h黑暗、恒溫、恒濕環(huán)境下。每組10只，隨機(jī)分為4組，共40只。4組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3周后，根據(jù)組別分別喂養(yǎng)普食飼料及3種高脂飼料,4種飼料蛋白質(zhì)的熱量占比均為20%。小鼠分組如下：A組：碳水化合物占70%，脂肪占10%；B組：碳水化合物占20%，脂肪占60%，脂肪來(lái)源主要為可可脂；C組：碳水化合物占5%，脂肪占75%，脂肪來(lái)源主要為可可脂；D組：碳水化合物占20%，脂肪占60%，脂肪來(lái)源為豬油。開始喂養(yǎng)后定期記錄攝食量，每周測(cè)量小鼠體質(zhì)量。麻醉后處死并測(cè)量肝重。

3.代謝評(píng)估：開始后第4周、第24周測(cè)量隨機(jī)血糖水平并留取血清。第22周禁食12h后，測(cè)量空腹血糖并留取血清。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定隨機(jī)及空腹胰島素水平。

4.腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)(introperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)及丙酮酸耐量試驗(yàn)(pyruvate tolerance test，PTT)：小鼠禁食12h，按2g/kg體質(zhì)量腹腔注射葡萄糖溶液或丙酮酸溶液，分別于0、30及120min測(cè)量血糖水平。

5.胰島素耐量試驗(yàn)(insulin tolerance test，ITT)：小鼠禁食6h，按1U/kg體質(zhì)量腹腔注射胰島素溶液，分別于0、30及120min測(cè)量血糖水平。

6.食物選擇試驗(yàn)：8只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為4籠，每籠2只，同時(shí)給予足量普通飲食飼料(70%碳水化合物，10%脂肪)及60%高脂飼料(60%脂肪，來(lái)源主要為豬油，20%碳水化合物)，每天記錄兩種飼料攝食量。

7.研究對(duì)象：選取2019年12月～2020年5月于筆者醫(yī)院內(nèi)分泌門診診療的2型糖尿病患者8例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①T2DM患者符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2017版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[10];②年齡>18歲;③糖化血紅蛋白≥7.5%且≤11.0%。排除標(biāo)準(zhǔn)：①1型糖尿病;②具有其他代謝相關(guān)疾病病史及DKA相關(guān)誘因;③肝腎功能異常者。研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核通過(guò)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

8.研究方法：患者在試驗(yàn)開始前接受試驗(yàn)者的健康宣傳教育，在原有糖尿病藥物基礎(chǔ)上自行進(jìn)行低碳飲食，試驗(yàn)期間禁止受試者攝入米面類主食、粗糧、雜糧及含淀粉的蔬菜等高碳食物(要求每日碳水化合物攝入量占總能量攝入的20%以下)，對(duì)進(jìn)食次數(shù)及數(shù)量無(wú)限制。開始前及開始1個(gè)月后記錄患者完整一天的飲食情況，并在期間不定期抽查(>10次/月)。禁食12h后，次日晨檢測(cè)患者空腹及餐后2h血糖。

結(jié) 果

喂養(yǎng)2周后，D組相較于A、B、C組出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量增長(zhǎng)(P均<0.01)，隨著喂養(yǎng)時(shí)間的增加，4組體質(zhì)量的差異逐漸增大。喂養(yǎng)24周后，體質(zhì)量差異進(jìn)一步增大(P=0.000，圖1A)。4組小鼠能量攝入差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，圖1B)，小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)快慢與能量攝入相一致。高脂飲食喂養(yǎng)后小鼠肝臟重量增加，C組肝重較A組增加37%(P=0.078)，D組肝重約為A組的2倍(P=0.000，圖1C)。喂養(yǎng)4周及24周后，4組隨機(jī)血糖比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.492、0.773，圖1D)。4組空腹、隨機(jī)胰島素水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.078、0.131，圖1E)。

圖1 不同飲食組小鼠代謝情況A.體質(zhì)量；B.攝食量；C.肝重；D.隨機(jī)血糖；E胰島素。與A組比較，*P<0.05，**P<0.01；與B組比較，#P<0.05，##P<0.01；與C組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

IPGTT結(jié)果表明，D組各點(diǎn)血糖顯著高于其他3組(P均為0.000)。ITT結(jié)果顯示禁食6h后，A組各時(shí)間點(diǎn)血糖低于B、C、D組(P均<0.05)，D組注射胰島素后120mim血糖積顯著高于B組及C組(P均為0.000)。PTT 結(jié)果表明，禁食12h后，A組、B組、C組及D組空腹血糖依次顯著升高(P<0.05)，A組注射丙酮酸后30min血糖顯著低于B、C、D組(P均<0.05)，而D組注射丙酮酸后曲線下面積顯著高于A、B、C組[1264.00±60.72mmol/(L·min) vs 760.70±92.57mmol/(L·min) vs 1014.00±100.60mmol/(L·min) vs 1012.00±191.10mmol/(L·min)，P均<0.05]，詳見圖2。以上結(jié)果提示，B、C、D組小鼠相較A組小鼠出現(xiàn)胰島素耐量和丙酮酸耐量異常，D組異常最為明顯。

圖2 葡萄糖耐量試驗(yàn)、胰島素耐量試驗(yàn)及丙酮酸耐量試驗(yàn)中血糖變化情況A.IPGTT；B.ITT；C.PTT；與A組比較，*P<0.05，**P<0.01；與B組比較，#P<0.05，##P<0.01；與C組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

同時(shí)給予普通飲食飼料及高脂飼料后，小鼠每日高脂飼料攝入量顯著高于普通飼料(P均為0.000,圖3)。

圖3 小鼠食物選擇試驗(yàn)兩組比較，*P<0.01

2型糖尿病患者低碳飲食1個(gè)月后攝入能量及體重較飲食前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，碳水化合物比例減少，脂肪和蛋白比例顯著上升(P值分別為0.000、0.003、0.000)?；颊呖崭辜安秃?h血糖顯著下降(P值分別為0.013、0.002，圖4)。

圖4 糖尿病患者低碳飲食前及飲食后1個(gè)月變化情況A.能量攝入；B.體重；C.血糖；D～F.飲食結(jié)構(gòu)分別為碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)

討 論

本研究在固定蛋白質(zhì)比例，排除其對(duì)小鼠體質(zhì)量及糖代謝的影響后，發(fā)現(xiàn)C組和D組小鼠早期即出現(xiàn)體質(zhì)量的增加，隨著喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各高脂飲食組與普通飲食組之間的體質(zhì)量差異逐漸增大，體質(zhì)量增長(zhǎng)與能量攝入相一致，并出現(xiàn)胰島素抵抗及糖異生增加。Hu等[11]研究也發(fā)現(xiàn)在控制蛋白質(zhì)比例后，隨著脂肪含量的上升，BALB/c小鼠、C3H小鼠、DBA/2小鼠及FVB小鼠的平均體質(zhì)量均隨之增加。表明高脂飲食在小鼠中更傾向于誘發(fā)肥胖及糖脂代謝的紊亂。

一項(xiàng)12周的短期臨床試驗(yàn)表明，相較于低脂飲食，低碳飲食組的糖尿病受試者出現(xiàn)更明顯的體重下降，更多低碳飲食組受試者減少胰島素的使用(85% vs 22%)[12]。長(zhǎng)期臨床試驗(yàn)也表明低碳飲食可改善體重[13, 14]。這與動(dòng)物模型得出的結(jié)論正好相反。

本研究中小鼠在進(jìn)食同種來(lái)源脂肪時(shí)，攝入能量及體質(zhì)量隨脂肪比例增高而增加。同樣以可可脂為主要脂肪來(lái)源，D組小鼠喂養(yǎng)24周后能量攝入較C組小鼠增長(zhǎng)8.2%，平均體質(zhì)量增加了15.5%。既往研究提示使用豬油作為主要脂肪來(lái)源的60%高脂飼料喂養(yǎng)小鼠18周后平均體質(zhì)量及每日能量攝入顯著增加[15, 16]。本研究也發(fā)現(xiàn)以豬油為主要脂肪來(lái)源的小鼠(D組)體質(zhì)量及攝食量均高于以可可脂為主的同脂肪比例同周齡小鼠(B組)，甚至高于以可可脂為主的75%高脂飲食小鼠(C組)。而在同時(shí)給予普通飼料及高脂飼料時(shí)，小鼠飲食以高脂飼料為主，幾乎不攝入普通飼料。筆者猜測(cè)以上現(xiàn)象是因?yàn)樾∈蟾蛴跀z入高脂飲食，隨飼料中脂肪含量增高，對(duì)小鼠食欲的刺激作用更為明顯，豬油對(duì)小鼠的刺激作用大于可可脂，而脂肪對(duì)人群的食欲無(wú)刺激作用。本實(shí)驗(yàn)在一定程度上證明小鼠體質(zhì)量增加與能量攝入關(guān)系更為密切，而非飲食結(jié)構(gòu)。

本研究人群納入對(duì)象為血糖控制欠佳的2型糖尿病患者，受試者基線日常飲食中碳水化合物比例約40%，明顯低于平均約50%的中國(guó)居民碳水?dāng)z入量，推測(cè)患者為改善血糖已自發(fā)性地降低碳水化合物攝入。本研究中將碳水的攝入量進(jìn)一步降低至總熱卡20%以下，空腹及餐后血糖出現(xiàn)明顯改善。既往一項(xiàng)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一旦限制肥胖受試者碳水化合物的攝入，即使不限制能量攝入，也會(huì)出現(xiàn)能量攝入減少[17]。然而本研究觀察到2型糖尿病患者低碳飲食后攝入能量無(wú)明顯變化，考慮原因?yàn)榛€時(shí)患者已降低碳水化合物攝入，總熱量減少，低碳后就沒(méi)有進(jìn)一步降低攝入量。本研究結(jié)果表明，對(duì)于2型糖尿病患者，在同等能量攝入下，低碳飲食能夠明顯改善血糖。

綜上所述，喂養(yǎng)低碳高脂飲食后，小鼠攝入能量增多，體質(zhì)量增加，并伴有胰島素抵抗及糖代謝紊亂。而2型糖尿病患者在進(jìn)入低碳飲食后能量攝入不變，代謝改善，因此小鼠難以模擬人體低碳飲食后的代謝變化。