李一凡 杜冀暉 趙 慧 李啟鳳 方麗珊 周瑜瑾 龔 慧

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是消化系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年結(jié)直腸癌全球發(fā)生率為6.1%，居惡性腫瘤第3位，其病死率為9.2%，居惡性腫瘤第2位，總計(jì)超過(guò)180萬(wàn)例結(jié)直腸癌新增病例和881000例死亡病例，約占所有癌癥死亡病例的1/10[1]。因此，有必要尋找更特異的結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物。

脂筏是細(xì)胞膜上直徑約為10～200nm的微小區(qū)域，富含大量膽固醇、神經(jīng)鞘磷脂等物質(zhì)及caveolins(CAVs)、flotillin-1(FLOT1)、flotillin-2(FLOT2)、prohibitin (PHB)、stomatin(EPB72)-like 2(STOML2)等組成性蛋白，參與細(xì)胞膜運(yùn)輸及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多生理過(guò)程。近期研究發(fā)現(xiàn)，脂筏蛋白在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，提示其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演了一定角色。脂筏蛋白FLOT1在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)并發(fā)揮調(diào)控作用[2]。FLOT2最近被確定參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，例如乳腺癌、黑色素瘤、宮頸癌、肺癌、肝癌、腎癌和胃癌，這提示FLOT2可能在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用[3～10]。然而，F(xiàn)LOT2表達(dá)水平與結(jié)直腸癌中表達(dá)水平、生物學(xué)功能和分子調(diào)控機(jī)制尚待闡明。本研究采用熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)FLOT2在結(jié)直腸癌中表達(dá)，探討FLOT2表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征及患者生存預(yù)后之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供思路。

資料與方法

1.標(biāo)本資料:收集2013～2014年在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬深圳第六醫(yī)院確診為結(jié)直腸癌的患者手術(shù)切除癌組織及相應(yīng)癌旁非瘤組織標(biāo)本，共4對(duì)。收集后立即放至液氮中保存。收集2003～2012年結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除的癌組織石蠟切片，共157例，并將這157份標(biāo)本納入統(tǒng)計(jì)分析。上述標(biāo)本由兩名高級(jí)病理醫(yī)生在石蠟切片和免疫組化染色后獨(dú)立評(píng)估。所有結(jié)直腸癌患者術(shù)前均未接受化療、放療和免疫治療。本研究經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬深圳第六醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)?；颊吲R床資料詳見(jiàn)表1。

2.主要試劑: 兔抗人FLOT2多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，稀釋濃度為1∶1000，免疫組化SP法試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司，DAB試劑盒購(gòu)于北京中山金橋公司。

3.免疫組織化學(xué)染色: 所有標(biāo)本用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋。免疫組化采用SP法，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。樣品經(jīng)烘烤、脫蠟、水化，用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過(guò)氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，用血清封閉非特異性表位。在4℃冰箱孵育一抗過(guò)夜后，37℃孵箱孵育二抗15min。用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯影后，蘇木精復(fù)染、鹽酸乙醇分化后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，最后用中性樹(shù)脂封片。

4.結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn): FLOT2蛋白主要定位于細(xì)胞膜，從顏色為淡黃色至棕黃色。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)(×400)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，即在10個(gè)高倍鏡視野下所有著色的細(xì)胞(即表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞)與視野下所有細(xì)胞的比值。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:陽(yáng)性細(xì)胞百分比<25%為0分，25%～50%為1分，>50%且≤75%為2分，>75%為3分。染色程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：根據(jù)細(xì)胞染色程度，無(wú)染色為0分、淡黃色為1分、黃色為2分、褐色為3分。最終的染色評(píng)分為陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分×染色程度評(píng)分的乘積，即0、1、2、3、4、6、9分，以中位數(shù)3作為截?cái)嘀?cut-off)，0～3分為低或不表達(dá)，>3分為高表達(dá)。

表1 結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征和FLOT2的表達(dá)

結(jié) 果

1．結(jié)直腸癌組織中FLOT2表達(dá)水平上調(diào)：通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)4對(duì)CRC腫瘤及相應(yīng)癌旁非腫瘤組織標(biāo)本中FLOT2的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CRC組織中FLOT2 mRNA表達(dá)水平上調(diào)?；颊逜、患者B、患者C、患者D的CRC腫瘤組織標(biāo)本中FLOT2的mRNA相對(duì)定量值與相應(yīng)癌旁非腫瘤組織標(biāo)本中FLOT2的mRNA表達(dá)相對(duì)定量值的比值分別是6.00、4.10、5.34、8.05，經(jīng)Student′sttest檢驗(yàn),P<0.05，各患者的癌與癌旁FLOT2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，相對(duì)定量值指的是FLOT2 mRNA與內(nèi)參基因GAPDH mRNA的比值。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，F(xiàn)LOT2陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞膜。FLOT2在4例結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)均為陽(yáng)性，高于相應(yīng)癌旁非腫瘤組織(圖1)。

圖1 FLOT2在CRC石蠟組織切片中表達(dá)水平上調(diào)(×200)病理切片為二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色后，蘇木精復(fù)染。紅色箭頭指示FLOT2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞

2.FLOT2的表達(dá)水平與相應(yīng)臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性：免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)LOT2在正常的結(jié)直腸組織切片中表達(dá)極低，而在低度惡性組(Ⅰ/Ⅱ)中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，在高度惡性組(Ⅲ/Ⅳ)中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。根據(jù)免疫組化評(píng)分將157例結(jié)直腸癌標(biāo)本分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。兩組的對(duì)比結(jié)果分析顯示FLOT2的表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)直腸癌患者的Dukes分期(P=0.013)、臨床分期(P=0.013)、T分期(P=0.001)、N分期(P=0.021)、M分期(P=0.016)、組織分化(P=0.016)和患者生存預(yù)后(P=0.025)顯著相關(guān)，而與患者的年齡、性別和腫瘤位置無(wú)顯著相關(guān)性(表2)。

圖2 免疫組化檢測(cè)FLOT2在癌旁非腫瘤組織和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)(臨床階段Ⅰ～Ⅳ)A、B.FLOT2在癌旁非腫瘤組織表達(dá)；C、D.FLOT2在腫瘤臨床分期Ⅰ期結(jié)直腸癌組織表達(dá)；E、F.FLOT2在腫瘤臨床分期Ⅱ期結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)；G、H.FLOT2在腫瘤臨床分期Ⅲ期結(jié)直腸癌組織的表達(dá)；I、J.FLOT2在腫瘤臨床分期Ⅳ期結(jié)直腸癌組織表達(dá)。病理切片為二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色后，蘇木精復(fù)染

表2 FLOT2的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系[n(%)]

3.FLOT2的表達(dá)水平在結(jié)直腸癌患者中的預(yù)后價(jià)值：根據(jù)免疫織化評(píng)分結(jié)果，筆者將157例結(jié)直腸癌標(biāo)本分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，并對(duì)FLOT2高表達(dá)和低表達(dá)的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。Kaplan-Meier存活曲線顯示FLOT2的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的總生存率顯著相關(guān)，F(xiàn)LOT2高表達(dá)病例組的生存時(shí)間明顯少于FLOT2低表達(dá)病例組，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.907，P=0.015，圖3)。

圖3 結(jié)直腸癌患者FLOT2低表達(dá)組和FLOT2高表達(dá)組的生存曲線

討 論

配體與相應(yīng)受體在脂筏區(qū)域的動(dòng)態(tài)募集是諸多信號(hào)通路激活的關(guān)鍵。脂筏為NF-κB、WNT/β-catenin、EGFR (epidermal growth factor receptor)、TCR (T cell antigen receptor)、BCR (B cell antigen receptor)等信號(hào)通路的激活提供了分子募集激活平臺(tái)。TNFR與TNF-α結(jié)合并轉(zhuǎn)位至脂筏，募集RIP及TRAF2等，形成信號(hào)分子復(fù)合體，從而激活NF-(B信號(hào)通路[11]。研究證實(shí)脂筏是IL-1β、LPS和CD3/CD28等介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路激活過(guò)程中所必需[12～14]。脂筏區(qū)域內(nèi)存在諸多與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白，如GPI錨聯(lián)蛋白、G蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體和激酶等。脂筏和脂筏蛋白在細(xì)胞膜上執(zhí)行正常功能，起到類似于轉(zhuǎn)化器信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，如果某些脂筏蛋白表達(dá)增加，意味著轉(zhuǎn)換器信號(hào)增多，過(guò)多信號(hào)促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。許多參與癌癥發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受脂筏調(diào)節(jié)。腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)脂筏蛋白有多種，如caveolin-1(CAV1)、FLOT1和STOML2等。FLOT1可通過(guò)激活NF-κB和β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮促癌作用。近期研究發(fā)現(xiàn)脂筏蛋白FLOT2在若干腫瘤中表達(dá)增高，提示其也可能有促癌作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中FLOT2表達(dá)水平顯著增高。FLOT2在低度惡性組(Ⅰ/Ⅱ)中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，在高度惡性組(Ⅲ/Ⅳ)中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。FLOT2的表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)直腸癌患者的Dukes分期、臨床分期、T分期、N分期、M分期、組織分化和生存預(yù)后呈顯著相關(guān)，而與患者的年齡、性別和腫瘤位置無(wú)顯著相關(guān)性。Kaplan-Meier存活曲線顯示FLOT2的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的總生存率顯著相關(guān)。

最近研究表明，F(xiàn)LOT2參與調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞(如胰腺癌干細(xì)胞)特征[15]。筆者發(fā)現(xiàn)FLOT2無(wú)表達(dá)或低表達(dá)的結(jié)直腸癌組織高分化比例偏高，F(xiàn)LOT2高表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中分化和低分化比例較高，該發(fā)現(xiàn)提示FLOT2與腫瘤分化程度密切相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)是否與FLOT2對(duì)腫瘤干細(xì)胞特征調(diào)節(jié)有關(guān)尚有待研究。FLOT2的表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)直腸癌患者的Dukes分期、臨床分期、生存預(yù)后顯著相關(guān)，提示結(jié)直腸癌FLOT2表達(dá)水平有望成為預(yù)判結(jié)直腸癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。另外，筆者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LOT2的表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)直腸癌患者的T分期、N分期和M分期顯著相關(guān)，F(xiàn)LOT2的表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別和腫瘤位置無(wú)相關(guān)性，這些發(fā)現(xiàn)與前期報(bào)道一致[16]。筆者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LOT2的高表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的總生存率顯著相關(guān)(χ2=5.907，P=0.015)，該結(jié)果也與前期報(bào)道結(jié)果一致[16～18]。

FLOT2高表達(dá)可促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移，但FLOT2在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制尚未有明確結(jié)論[17]。有研究顯示，與結(jié)腸直腸正常細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)移性SW620細(xì)胞衍生的脂質(zhì)體中選擇性富集脂質(zhì)筏和脂質(zhì)筏相關(guān)蛋白(CAV1、FLOT1、FLOT2、PROM1)，提示FLOT2可能與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。研究表明，抑制FLOT2可以通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/FOXO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[20]。FLOT2缺乏癥可導(dǎo)致小鼠乳腺癌模型的肺轉(zhuǎn)移減少[21]。FLOT2可通過(guò)與PLCD3相互作用參與鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[22]。FLOT2促進(jìn)鼻咽癌(NPC)轉(zhuǎn)移，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β, TGF-β)誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化所必需的[23]。

FLOT2蛋白在結(jié)直腸癌中表達(dá)增高，其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床分期、TNM分期、病理分化程度和患者總體生存率顯著相關(guān)，因此FLOT2有可能成為評(píng)估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的新的分子標(biāo)志物。在未來(lái)研究中，F(xiàn)LOT2蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用和機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。