張媛 常思源

摘 要：鼠李糖脂是一種重要的生物表面活性劑，在石油開采、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化妝品及生物降解等不同領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。鼠李糖脂低產(chǎn)量、高成本的劣勢(shì)極大地限制了其更為廣泛的應(yīng)用。研究銅綠假單胞菌PC-1以廉價(jià)的玉米秸稈稀酸解液生產(chǎn)鼠李糖脂的工藝，進(jìn)一步對(duì)鼠李糖脂的發(fā)酵培養(yǎng)氮源和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)玉米秸稈稀酸解液和含糖濃度NaNO3分別設(shè)定為20.0 g/L和15.0 g/L時(shí)，鼠李糖脂產(chǎn)量可達(dá)19.3 g/L。

關(guān)鍵詞：鼠李糖脂;銅綠假單胞菌PC-1;玉米秸稈稀酸解液

在中國，每年玉米秸稈的產(chǎn)量約有3.5億t，但長期以來僅有小部分的玉米秸稈用作飼養(yǎng)牲畜的粗飼料，大部分玉米秸稈被用作燃料或者直接焚燒，這不僅是資源的巨大浪費(fèi)，也會(huì)對(duì)環(huán)境造成巨大污染[1]。鼠李糖脂（Rhamnolipid）是由假單胞菌或伯克氏菌類產(chǎn)生的一種生物代謝性質(zhì)的表面活性劑[2]。親水基團(tuán)主要由1～2個(gè)鼠李糖環(huán)構(gòu)成，憎水基團(tuán)則由1～2個(gè)不同碳鏈長度的脂肪酸構(gòu)成。鼠李糖脂具有乳化、增溶、分散、凝聚和降低界面張力等特性，已應(yīng)用于石油開采、生物降解、食品保鮮劑等領(lǐng)域[3-5]。鼠李糖脂通常以微生物發(fā)酵制得，然而鼠李糖脂生產(chǎn)成本過高以及產(chǎn)率低，限制了其規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用[6]。

玉米秸稈作為一種廉價(jià)易得的碳源，以其為原料生物合成鼠李糖脂，不僅可以有效降低生產(chǎn)鼠李糖脂的成本，而且降低了玉米秸稈的治理成本，實(shí)現(xiàn)了玉米秸稈的資源化利用。本研究以本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PC-1為出發(fā)菌株，以玉米秸稈稀酸解液為碳源生產(chǎn)鼠李糖脂，并優(yōu)化了氮源種類，旨在建立鼠李糖脂的廉價(jià)生產(chǎn)工藝。

1 ? ?材料與方法

1.1 ?培養(yǎng)基與菌株

銅綠假單胞菌PC-1由本實(shí)驗(yàn)室分離篩選獲得。

平板培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂20 g/L。

初始發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：Ca（OH）2中和預(yù)處理的玉米秸稈酸解液，NaNO3 0.5 g/L，KH2PO4 0.10 g/L，Na2HPO4·12H2O ?0.10 g/L，MgSO4 0.01 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g/L，CaCl2·2H2O ?0.01 g/L。

1.2 ?玉米秸稈酸解液的酸解獲取

先將玉米秸稈放置在烘箱中進(jìn)行烘干處理，取出后研磨處理成直徑約為100目的顆粒。稱取600 g玉米秸稈顆粒，將玉米秸稈顆粒與2%的稀硫酸混合（固液比為1∶10）后，121 ℃酸解1 h，待冷卻后使用紗布過濾，去除玉米秸稈殘?jiān)蟮那逡杭礊橛衩捉斩捤峤庖骸?/p>

酸解過程中會(huì)產(chǎn)生甲酸、乙酸以及糠醛等抑菌成分，且酸解液的pH比較低，使用Ca（OH）2將玉米芯酸解液的pH直接調(diào)節(jié)到10，再回調(diào)至6.5。去除沉淀CaSO4后的酸解液直接用于后續(xù)的發(fā)酵。

1.3 ?銅綠假單胞菌PC-1發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的氮源優(yōu)化

采用發(fā)酵初始培養(yǎng)基，以NaNO3、NH4Cl、NH4NO3和（NH4）2SO4為無機(jī)氮源（初始添加量為5 g/L），以酵母粉、牛肉膏及蛋白胨為有機(jī)氮源（初始添加量為10 g/L），分析氮源種類對(duì)發(fā)酵的影響。

1.4 ?鼠李糖脂含量檢測(cè)

采用苔黑酚法測(cè)定鼠李糖脂含量[7]。鼠李糖脂基在濃硫酸作用下脫水形成糠醛類化合物，與地衣酚結(jié)合顯藍(lán)綠色，可用分光光度計(jì)測(cè)定421 nm處的吸收值。

2 ? ?結(jié)果與討論

2.1 ?玉米秸稈稀酸解液各組分測(cè)定

將玉米秸稈稀酸解液中和處理后的樣品參照美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)的方法，采用高效液相色譜儀測(cè)定各組分，結(jié)果如表1所示。玉米秸稈稀酸解液以Ca（OH）2中和工藝處理后，總糖質(zhì)量濃度約為27.8 g/L，其中，木糖質(zhì)量濃度約為18.1 g/L，占總糖組分的65%左右，培養(yǎng)基中還含有阿拉伯糖6.5 g/L、葡萄糖1.6 g/L，乙酸約4.7 g/L，甲酸、糠醛等抑制物組分未檢出。

2.2 ?玉米秸稈稀酸解液發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂

將Ca（OH）2中和的玉米秸稈酸解液的總還原糖質(zhì)量濃度調(diào)整到20 g/L作為碳源，發(fā)酵培養(yǎng)5 d，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)以酸解液為碳源時(shí)，鼠李糖脂產(chǎn)量為5.7 g/L;由于酸解液中主要含有木糖和阿拉伯糖，考察以木糖和阿拉伯糖為碳源對(duì)鼠李糖脂產(chǎn)量的影響。在同樣條件下，木糖產(chǎn)量（6.4 g/L）顯然優(yōu)于阿拉伯糖（5.1 g/L）。不同碳源對(duì)菌株P(guān)C-1的生長量也有影響，以木糖為碳源的生長量最高。這些結(jié)果說明，銅綠假單胞菌PC-1具有良好的木糖代謝能力，能以廉價(jià)的玉米秸稈酸解液生長并生產(chǎn)鼠李糖脂。故玉米秸稈酸解液可作為菌株P(guān)C-1生產(chǎn)鼠李糖脂的碳源。

2.3 ?銅綠假單胞菌PC-1生產(chǎn)鼠李糖脂發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 ?氮源對(duì)菌株P(guān)C-1生產(chǎn)鼠李糖脂的影響

氮源也是微生物合成代謝產(chǎn)物重要營養(yǎng)物質(zhì)。本研究考察NaNO3、NH4Cl、NH4NO3、（NH4）2SO4、酵母粉、牛肉膏及蛋白胨等7種氮源對(duì)菌株P(guān)C-1產(chǎn)鼠李糖脂的影響，結(jié)果如圖2所示，NaNO3最有利于鼠李糖脂的合成，蛋白胨對(duì)菌體生長最為有利。以NaNO3為氮源時(shí)，鼠李糖脂產(chǎn)量最高達(dá)12.4 g/L，而以NH4Cl、NH4NO3和（NH4）2SO4作為氮源時(shí)，菌株P(guān)C-1產(chǎn)的鼠李糖脂產(chǎn)量較低，可能該菌株不善于利用氨類氮源。此外，有機(jī)氮源更有利于菌體PC-1的生長，而無機(jī)氮源則更有利于產(chǎn)物積累。故選用NaNO3為菌株P(guān)C-1生產(chǎn)鼠李糖脂的氮源。

2.3.2 ?碳氮比對(duì)菌株P(guān)C-1生產(chǎn)鼠李糖脂的影響

碳氮比（C/N）對(duì)微生物的生長和代謝有著重要影響，在上述最佳碳源氮源下，進(jìn)一步調(diào)整碳源氮源的投加比，以10 g/L NaNO3為氮源，調(diào)節(jié)酸解液含糖質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 g/L，發(fā)現(xiàn)酸解液含糖質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，菌株P(guān)C-1的鼠李糖脂產(chǎn)量最高達(dá)17.7 g/L，故確定酸解液含糖質(zhì)量濃度最佳為30 g/L。控制酸解液含糖質(zhì)量濃度為 ? ? 30 g/L，調(diào)節(jié)NaNO3的質(zhì)量濃度分別為10、15、20、25、30 g/L，測(cè)得NaNO3為15 g/L時(shí)，菌株P(guān)C-1的鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到最大值18.5 g/L。因此，在后續(xù)研究中，培養(yǎng)基酸解液含糖質(zhì)量濃度及NaNO3分別設(shè)定為20.0 g/L和15.0 g/L。

3 ? ?結(jié)語

以實(shí)驗(yàn)室自行篩選保存的銅綠假單胞菌PC-1為出發(fā)菌株，利用廉價(jià)的玉米秸稈稀酸解液為碳源生產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂，進(jìn)一步對(duì)鼠李糖脂的發(fā)酵培養(yǎng)氮源進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)玉米秸稈稀酸解液含糖質(zhì)量濃度和NaNO3質(zhì)量濃度分別設(shè)定為20.0 g/L和15.0 g/L時(shí)，鼠李糖脂產(chǎn)量可達(dá)19.3 g/L。

[參考文獻(xiàn)]

[1]張紅漫，雷鳴柳，鄭榮平，等.HPLC法測(cè)定蒸汽爆破玉米秸稈水解液中的糖含量[J].食品科技，2011，36（6）：292-296.

[2]陳利娟，吳斌，何冰芳.ARTP誘變選育鼠李糖脂高產(chǎn)菌及鼠李糖脂促進(jìn)枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（11）：195-201.

[3]張婧波，吳劍榮，蔣蕓，等.以抽油煙機(jī)廢油為原料發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2018，34（5）：195-200.

[4]楊佐毅，崔佳豪，李平凡，等.一株銅綠假單胞菌的篩選鑒定及其產(chǎn)鼠李糖脂條件的優(yōu)化[J].環(huán)境污染與防治，2018，40（2）：128-132.

[5]張熠，劉洋，陳鵬，等.銅綠假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的研究[J].食品與發(fā)酵科技，2019，55（1）：1-4.

[6]蔡京榮，呂佳佳.生物表面活性劑鼠李糖脂研究概況[J].中國洗滌用品工業(yè)，2019（4）：60-67.

[7]KOCH A K，KAPPELI O，F(xiàn)IECHTER A，et al.Hydro carbon assimilation and biosurfactant production in Pseudomonas aeruginosa mutants[J].Journal of Bacteriology，1991，173（13）：4214-4219.

Study on ?cost-effective production of rhamnolipid from biomass waste by fermentation

Zhang Yuan， Chang Siyuan

（1.Nanjing Zoonbio Biotechnology Co. Ltd.， R&D Department， Nanjing 210034， China; 2.College of Biology and

Environment， Nanjing Polytechnic Institute， Nanjing 210048， China）

Abstract：Rhamnolipid is an important biosurfactant， which is widely used in petroleum exploitation， agriculture， medicine， cosmetics and biodegradation. The low yield and high cost of rhamnolipid limit its wider application. In this study， the technology of rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa PC-1 was studied. Furthermore， the nitrogen source and fermentation conditions of rhamnolipid were optimized. When the mass concentrantions of corn straw dilute acid hydrolysate and NaNO3 were set at 20.0 g/L and 15.0 g/L respectively， the rhamnolipid yield was 19.3 g/L.

Key words：rhamnolipid; Pseudomonas aeruginosa PC-1; corn straw dilute acid hydrolysate

基金項(xiàng)目：南京科技職業(yè)學(xué)院校級(jí)科研課題（NHKY-2019-18）

作者簡(jiǎn)介：張媛（1986— ），女，工程師，碩士;研究方向：生物醫(yī)藥。

通信作者：常思源（1986— ），男，講師，博士;研究方向：生物產(chǎn)品分離提取。