于 棟，高 洋，何新蕾

（1.漯河食品職業(yè)學院 食品工程系，河南 漯河 462300；2.漯河醫(yī)學高等專科學校 基礎醫(yī)學部，河南 漯河 462300）

黑豆粕是黑大豆經過榨油后得到的不規(guī)則的硬塊狀的物質，一般為淡青色或淺褐色，有烤豆類的香味。在我國榨油所得的黑豆粕幾乎都用于飼料行業(yè)中，作為飼料蛋白的原料，用來替代魚粉[1]，但國外一些公司則大量購進黑豆粕，進行發(fā)酵或提取活性物質，來提高黑豆粕副產品的開發(fā)利用。黑豆粕中有40%的蛋白并沒有得到真正利用，這樣就會造成大量黑豆蛋白的浪費[2]。所以，利用黑豆粕粉制備出具有生物活性的黑豆粕多肽，對于黑豆產品的開發(fā)具有重要意義。

黑豆多肽是經過酶水解法或發(fā)酵方法所得的混合肽，其相對分子質量＜10 000 Da，含有不同的氨基酸序列[3]。黑豆多肽溶液中不僅含有人體所需的8種必需氨基酸，而且含量較高。根據相關研究顯示[4]，人體攝入的蛋白質并不完全是以單個的氨基酸被機體吸收利用的，小分子的多肽與單個氨基酸相比，小分子的肽更易于吸收[5]，在機體發(fā)揮重要的作用。有資料表明[6-9]，黑豆多肽具有抗氧化性，可以及時清除體內多余的自由基，對于增強機體抵抗疾病的侵襲具有十分重要的意義[10-12]；同時適量攝入黑豆多肽還可以有效的緩解體力疲勞[13]。黑豆多肽對于心血管疾病患者也有一定的預防作用[14]。由于其價廉易得，安全性高，因此具有良好的開發(fā)前景[15]。目前制備黑豆多肽的方法主要有化學法、酶解法和超聲波輔助提取法[16-18]。酶解法由于所得的產物沒有毒性，對機體不會產生副作用，而且操作條件易控制，所以是制備生物活性肽最常用的方法[19-20]。任海偉等[21]以黑豆豆渣為原料，分別采用木瓜蛋白酶（溫度50 ℃、pH6.5條件下水解3 h）、堿性蛋白酶（pH9.0條件下水解3 h）處理黑豆豆渣，最終得到的產物中氨基酸態(tài)氮含量為2.17%，溶解度為98.25%。

該研究以黑豆粕粉為原料，通過酶解法制備具有生物活性的黑豆多肽，主要采用響應面法對影響黑豆多肽酶解的時間、溫度、pH、酶添加量等因素進行優(yōu)化，以期為黑豆類產品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆粕粉：蘇州市黑土地食品有限公司；風味蛋白酶（2.6×105U/mL）、中性蛋白酶（2.5×105U/mL）、堿性蛋白酶（2.8×105U/mL）、木瓜蛋白酶（2.0×105U/mL）、胰蛋白酶（2.5×105U/mL）：諾維信（中國）生物技術有限公司；鹽酸（分析純）：開封東大化工有限公司試劑廠；甲醛（分析純）：西隴化工股份有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

85-2型數顯恒溫磁力攪拌器：金華市瑞華試驗儀器廠；HH-2數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；YP3002型電子天平：北京京國藝科技發(fā)展有限公司；722型分光光度計：龍尼柯（上海）儀器有限公司；DELTA 320 pH計：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；LD5-10低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑豆粕粉蛋白溶液的制備

除脂肪→堿提→離心分離→收集上清液→酸沉→離心分離→收集沉淀→中和→水洗→黑豆粕粉蛋白溶液

黑豆粕粉過50目篩后，用石油醚回流脫脂6 h；在脫脂后的黑豆粕粉中按照1∶50的比例加水，用0.05 mol/L的NaOH調pH9.0～10.0，然后用4 000 r/min離心5 min、取上清液；加0.01 mol/L鹽酸調pH到4.0沉淀蛋白，將沉淀的蛋白用蒸餾水進行清洗，之后加入1∶50的水，再用0.05 mol/L的NaOH調至中性，得到黑豆粕粉的蛋白溶液。

1.3.2 蛋白酶的篩選

分別將3%的風味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶加入黑豆粕粉蛋白溶液中，調節(jié)至各酶最適的酶解溫度和pH，分別酶解0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，酶解過程中保持pH的恒定。酶解結束后，煮沸滅酶10 min，然后離心（4 000 r/min，5 min）、取上清液，測定蛋白水解度，比較5種酶的酶解效果。5種不同酶的酶解條件見表1。

表1 不同種類蛋白酶酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different kinds of protease

1.3.3 單因素試驗

確定最佳蛋白酶后，選擇酶解溫度、酶解pH、酶解時間、加酶量為因素進行單因素試驗。其中，酶解溫度設定為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃；酶解pH設定為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0；酶解時間設定為2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h；加酶量設定為1%、2%、3%、4%、5%。酶解結束后，煮沸滅酶10 min，然后離心、取上清液，測定上清液中的氨基酸肽氮含量，計算蛋白水解度。通過比較水解度的大小，確定各因素酶解工藝最適的條件。

1.3.4 黑豆粕粉多肽的工藝優(yōu)化

以酶解溫度（A）、酶解pH（B）、酶解時間（C）和加酶量（D）為影響因素，蛋白水解度（Y）為評價指標，運用Design Expert V8.0.6進行響應面試驗，對黑豆粕粉多肽的制備工藝進行優(yōu)化。響應面試驗因素與水平見表2。

表2 黑豆粕粉多肽制備工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology for black soybean meal polypeptide preparation process optimization

1.3.5 水解度的測定

采用pH-stat法測定蛋白質水解度（degree of hydrolysis，DH），水解度計算公式如下：

式中：CNaOH為標準氫氧化鈉的物質的量，mol/L；VNaOH為標準氫氧化鈉溶液的體積，mL；MP為底物蛋白質的質量（g）；α為氨基的平均解離度；htot為黑豆粕粉蛋白質的肽鍵總數。α=（pH為試驗時采用的pH，pK為氨基的解離常數，取7.0）。

1.3.6 多肽得率的測定

取7支試管，分別加入0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的10 mg/mL標準蛋白質溶液，用水補足至1 mL，然后加入4 mL雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20～25 ℃）下放置30 min，于波長540 nm處進行比色測定。用未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照液。以蛋白質的含量（x）為橫坐標，OD540nm值（y）為縱坐標繪制標準曲線。

通過線性回歸得到的標準方程為y=0.051 5x+0.007 3，R2=0.999 3?？扇苄远嚯暮坑嬎愎饺缦拢?/p>

2 結果與分析

2.1 黑豆粕粉蛋白酶的選擇

對比5種蛋白酶對黑豆粕粉蛋白水解效果，結果見圖1。由圖1可知，所選5種蛋白酶酶解3 h后，黑豆粕粉蛋白的水解度基本不變，且從各自的變化情況來看，堿性蛋白酶對黑豆粕粉的水解效果最好，最高水解度為16.6%，胰蛋白酶次之，水解度為11.2%，風味蛋白酶水解效果最差，水解度為5.2%。由于酶都具有專一性，每個蛋白酶作用的酶切位點不同，導致水解出來的多肽長短不同，數量不同[22]。堿性蛋白酶是以絲氨酸蛋白酶為主，對羧基側為芳香族的氨基酸（Tyr、Phe、Trp）水解能力最強；木瓜蛋白酶是以Arg、Lys、Gly、Cys為酶切位點；風味蛋白酶主要是氨肽酶與羧肽酶的復合，酶解能力較弱。因此，選擇堿性蛋白酶對黑豆粕粉進行水解。

圖1 不同蛋白酶對黑豆粕粉蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on protein hydrolysis degree of black bean meal

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶解溫度對黑豆粕粉蛋白水解效果的影響

圖2 酶解溫度對黑豆粕粉蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on protein hydrolysis degree of black bean meal

由圖2可知，酶解溫度為50～60 ℃時，水解度的變化較快，當酶解溫度為55 ℃時，水解度達到最大值。這是因為酶制劑都有一個合適的溫度范圍，當超過這個溫度范圍，酶制劑的活性會減低，進而使得水解程度的下降。所以選擇55 ℃作為最適的酶解溫度。

2.2.2 酶解pH對黑豆粕粉蛋白水解效果的影響

由圖3可知，隨著酶解pH值的增加，水解度先增大后減小，在酶解pH值為9時，水解度最大。這是由于酶制劑在最適的pH環(huán)境內，活性達到最佳，過高或過低的pH值，都會阻礙酶制劑與底物的結合。因此，選擇最適酶解pH值為9。

圖3 酶解pH對黑豆粕粉蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis pH value on protein hydrolysis degree of black bean meal

2.2.3 酶解時間對黑豆粕粉蛋白水解效果的影響

圖4 酶解時間對黑豆粕粉蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on protein hydrolysis degree of black bean meal

由圖4可知，黑豆粕粉水解度隨著酶解時間的增加呈先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。當酶解時間為1～3 h時，水解度的增加較快；當酶解時間為3 h時，水解度達到最大值，為24.4%；繼續(xù)延長酶解時間，水解度增加十分緩慢。這是由于蛋白酶剛接觸底物時，發(fā)生劇烈的水解反應，蛋白質上的氨基酸被大量切開，但當酶制劑作用位點上的氨基酸都被切開后，水解度基本不再增加。因此，選擇最佳酶解時間3 h為宜。

2.2.4 加酶量對黑豆粕粉蛋白水解效果的影響

由圖5可知，隨著加酶量的增加，水解度呈逐漸上升趨勢。當加酶量為4%時，黑豆粕粉蛋白的水解度達到最大值33.3%；當加酶量＞4%時，水解度趨于平緩。這可能是因為當酶的添加達到一定量時，其與底物的接觸已趨于飽和，水解度不再增加。因此，選擇加酶量4%為宜。

圖5 加酶量對黑豆粕粉蛋白水解度的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on protein hydrolysis degree of black bean meal

2.3 響應面試驗

根據單因素試驗結果，以酶解溫度（A）、酶解pH（B）、加酶量（C）和酶解時間（D）為影響因素，以黑豆粕粉蛋白的水解度（Y）為響應值，進行響應面試驗，優(yōu)化酶解參數，確定黑豆粕粉酶解的工藝條件。響應面試驗設計與結果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 黑豆粕粉多肽制備工藝優(yōu)化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface methodology for black soybean meal polypeptide preparation process optimization

表3 回歸方程模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation model

由表3方差分析結果可看出，模型P＜0.000 1，方程模型達到極顯著，失擬P=0.278 1＞0.05，不顯著，因此二次模型成立，應用此模型可以預測黑豆粕粉蛋白提取率及微波法輔助提取蛋白的工藝。由此獲得二次多項回歸方程：

Y=33.88+1A+1.41B+1.34C+1.82D-1.96AB-1.17BC+1.48BD-5.12A2-2.67B2-0.26C2-3.49D2，方程的決定系數為0.978，說明該模型能解釋97.8%響應值的變化，即該模型與實際試驗擬合良好，試驗誤差小。

由表3可知，方程模型極顯著，二次模型成立，由方程的復相關系數為0.978可知，得出的模型與實際試驗擬合良好，誤差小，可以用此模型預測黑豆粕粉蛋白的最佳水解工藝。酶解溫度與酶解pH、酶解pH與加酶量都有交互作用都到達顯著水平（P＜0.05），酶解pH與酶解時間交互作用極顯著（P＜0.01）。為確定最佳工藝，通過Design Expert V8.06軟件繪制響應面，結果見圖6。

由圖6可知，由于回歸方程的二次項系數均為負值，且響應面的開口向下，說明建立的方程有極大值。堿性蛋白酶水解黑豆粕粉的最佳制備條件為：酶解溫度55.43 ℃、酶解pH9.05、酶解時間4.34 h、加酶量4.34%。在此最佳條件下，蛋白水解度預測值為35.37%。為方便實際操作，將多肽的最佳制備條件修正為：酶解溫度55 ℃、酶解pH9、酶解時間260 min、加酶量4.3%。在此條件下，經3次驗證試驗，蛋白水解度為35.23%，與預測值相接近，說明方法可行。

圖6 酶解溫度、酶解pH、酶解時間與加酶量交互作用對黑豆粕粉蛋白水解度影響的響應面Fig.6 Response surface plots of effects of interaction between enzymolysis temperature,pH,time and enzyme addition on protein hydrolysis degree of black soybean meal

3 結論

本研究采用酶解法制備黑豆多肽。以水解度為考察指標，從風味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶中篩選水解效果最好的蛋白酶。通過單因素試驗考察酶解pH、加酶量、酶解溫度、酶解時間水對水解效果的影響，在此基礎上，采用響應面試驗對黑豆粕粉多肽的制備條件進行優(yōu)化。結果表明，堿性蛋白酶最適合酶解黑豆粕粉多肽，多肽的最優(yōu)制備條件為酶解溫度55 ℃、酶解pH 9、酶解時間260 min、加酶量4.3%。在此優(yōu)化條件下，蛋白的水解度為35.23%，與預測值相接近。為黑豆類產品的開發(fā)提供了參考。