張 栩

（長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物學(xué)院，吉林 長春 130033）

發(fā)酵是最常見的傳統(tǒng)食品加工和保存方式之一，至今有著幾千年的歷史[1]。發(fā)酵不僅可以延長食品的保質(zhì)期，還能增加其營養(yǎng)價值和風(fēng)味特性。發(fā)酵蔬菜是我國傳統(tǒng)的蔬菜加工品，因其獨特的風(fēng)味而在我國具有廣闊的消費(fèi)市場[2]。酸菜是我國傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜，通常是以大白菜為原料在低鹽浸漬下經(jīng)過微生物自然發(fā)酵而制成[3-4]。現(xiàn)在，酸菜已經(jīng)成為我國東北地區(qū)冬季的必備食品。酸菜在市場上的供應(yīng)越來越多，其生產(chǎn)規(guī)模也正在擴(kuò)大[5]。酸菜發(fā)酵過程中會發(fā)生許多物理和化學(xué)變化，這些變化會直接影響產(chǎn)品的品質(zhì)[6-7]。酸菜在加工工程中因其原料、產(chǎn)地、加工工藝等不同，故發(fā)酵周期、產(chǎn)品品質(zhì)及揮發(fā)性風(fēng)味成分也不同。因此，對于酸菜的商業(yè)化生產(chǎn)，控制發(fā)酵品質(zhì)是必要且重要的。

乳酸菌是酸菜發(fā)酵過程中活躍的主要微生物。多項研究表明，在酸菜發(fā)酵過程中，乳酸菌的種類是多樣的，且不同發(fā)酵時期的生物量也存在顯著差異，主要有腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacilus fermentum）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、寡發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus oligofermentum）及一些腸球菌屬（Enterococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）[8-11]。而這些微生物的新陳代謝會影響酸菜的口感和風(fēng)味。酸、酯、醇和含硫化合物是酸菜發(fā)酵過程中的主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物，還有一些萜、醛和酮可能會對酸菜風(fēng)味的形成起重要影響[12]。不同乳酸菌對酸菜發(fā)酵的作用效果皆不同[13]，尤其是對風(fēng)味物質(zhì)的影響尚不明確。本研究以白菜為原料，采用植物乳桿菌（L.plantarum）、干酪乳桿菌（L.casei）和腸膜明串珠菌（L.mesenteroides）作為發(fā)酵劑制作酸菜，通過生理生化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)成分探索不同乳酸菌對酸菜發(fā)酵效果的影響，并對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），揭示其在提高酸菜品質(zhì)和風(fēng)味方面的潛在應(yīng)用，旨在為酸菜發(fā)酵的強(qiáng)化技術(shù)和工業(yè)化加工提供理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

白菜、食鹽：市售；植物乳桿菌（L.plantarum）、干酪乳桿菌（L.casei）和腸膜明串珠菌（L.mesenteroides）：上海潤盈生物工程有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酒石酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、乙酸、草酸、琥珀酸（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BBS-DDC無菌操作臺：蘇州安康空氣技術(shù)有限公司；PB-10型pH計：德國Sartorius公司；UV1800型紫外可見光分光光度計：日本島津公司；1260型高效液相色譜儀、7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國Agilent公司；573000-U型固相微萃取手柄、固相微萃取探頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭）：美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液制備

將三種乳酸菌（植物乳桿菌（L.plantarum）、干酪乳桿菌（L.casei）和腸膜明串珠菌（L.mesenteroides））的保藏培養(yǎng)物分別置于MRS肉體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化復(fù)壯，活化復(fù)壯后再在MRS肉體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，然后4 500 r/min離心15 min，用無菌生理鹽水清洗沉淀菌落，進(jìn)而將其溶于蒸餾水中，配制成活菌數(shù)為5.6×108CFU/mL的菌懸液。

1.3.2 酸菜的制備

根據(jù)東北地區(qū)傳統(tǒng)方法進(jìn)行酸菜的腌制[14]，具體方法如下：挑選優(yōu)質(zhì)的大白菜，將其在室外晾曬2～3 d（曬蔫、殺菌、去除一定的水分）后，摘除黃葉、老幫并清洗干凈，將整顆大白菜縱劈成兩半，浸入沸水煮沸2 min，瀝干水分，冷卻后整齊擺入10 L的大缸中裝滿壓實并排出空氣，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的無菌食鹽水填滿密封，接種白菜總質(zhì)量1%的菌懸液于無菌食鹽水中，用塑料布將大缸扎緊，在室溫條件下發(fā)酵30 d，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。取發(fā)酵0、10 d、20 d、30 d的酸菜樣品進(jìn)行理化指標(biāo)測定。

1.3.3 分析檢測

pH值的測定采用pH計；可滴定酸（以乳酸計）含量的測定參考國標(biāo)GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》[15]；還原糖（以葡萄糖計）含量的測定采用DNS法[16]；亞硝酸鹽含量的測定采用鹽酸萘乙二胺法[17]。

采用高效液相色譜法測定有機(jī)酸含量。取適量酸菜樣品，加入等體積的硫酸鋅和亞鐵氰化鉀，搖勻，10 000 r/min離心20 min，保留上清液過0.45 μm水系濾膜后待用。色譜條件：進(jìn)樣量10 μL；流動相為0.02 mol/L的NaH2PO4溶液；柱流速0.8 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法測定酸菜樣品中風(fēng)味物質(zhì)成分[12]。

固相微萃取條件：稱取絞碎的4 g樣品置于20 mL頂空瓶中，加入8 mL去離子水和2 g NaCl，用聚四氟乙烯隔墊密封，在磁力攪拌器中50 ℃平衡15 min。然后將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中，頂空吸附40 min后，將萃取頭插入GC進(jìn)樣，解吸5 min。

氣相色譜條件：DBWAX色譜柱（30 m×250μm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；載氣為高純度氦氣（He）；流速為1.0 mL/min；升溫程序：35 ℃維持3 min，然后以6 ℃/min升溫至160 ℃，最后以10 ℃/min升溫至230 ℃，并維持5 min；質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV；連接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；掃描范圍（33 ℃）450 m/z。

定性方法：經(jīng)美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）08數(shù)據(jù)庫檢索定性；定量方法：采用面積歸一法。

1.3.4 主成分分析

采用SIMCA 14.2軟件對檢測到的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析（PCA），并繪制PCA得分圖和相應(yīng)的載荷圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸菜發(fā)酵過程中pH和可滴定酸度的變化

如圖1所示，在整個發(fā)酵過程中，酸菜的pH值呈下降趨勢；發(fā)酵20 d后，酸菜的pH值趨于穩(wěn)定。其中，腸膜明串珠菌發(fā)酵的酸菜的pH值可降低至3.28，而植物乳桿菌發(fā)酵的酸菜的pH值卻維持在3.38。這表明三種乳酸菌在酸菜發(fā)酵過程中均會產(chǎn)酸，其中腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。此外，可滴定酸的變化趨勢與pH值變化相反。在發(fā)酵0～20 d，三種乳酸菌發(fā)酵的酸菜中可滴定酸含量迅速上升；發(fā)酵20 d后，可滴定酸含量的增加速率變緩，其中植物乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵的酸菜中可滴定酸含量無顯著差異（P＞0.05），分別可達(dá)7.81 g/L和8.12 g/L，而腸膜明串珠菌發(fā)酵酸菜中可滴定酸含量卻顯著高于植物乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵的酸菜（P＜0.05），其可滴定酸含量可達(dá)8.69 g/L。接種三種不同乳酸菌發(fā)酵酸菜的可滴定酸含量顯著高于之前韓宏嬌等[14]報道的自然發(fā)酵酸菜在發(fā)酵50 d時總酸含量為6.68 g/kg（P＜0.05）。說明接種乳酸菌不僅可以加快發(fā)酵進(jìn)程，還有助于提高可滴定酸含量。

圖1 不同乳酸菌發(fā)酵酸菜的過程中pH和可滴定酸含量的變化Fig.1 Changes of pH value and titratable acid contents in the fermentation process of suan-cai by different lactic acid bacteria

2.2 酸菜發(fā)酵過程中還原糖和亞硝酸鹽的變化

還原糖是促進(jìn)微生物生長代謝的主要能源物質(zhì)之一。如圖2所示，在整個發(fā)酵過程中，三種乳酸菌發(fā)酵的酸菜中還原糖含量均呈下降趨勢，且下降趨勢相一致。在發(fā)酵0～20 d，三種乳酸菌發(fā)酵的酸菜中還原糖含量均下降，這是因為在這個時間內(nèi)乳酸菌可持續(xù)利用發(fā)酵液及原料中的還原糖進(jìn)行生長繁殖，需要消耗大量的糖。發(fā)酵20 d后，三種乳酸菌發(fā)酵的酸菜中還原糖含量雖繼續(xù)下降，但下降速率放緩，這可能是因為乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，使酸菜發(fā)酵體系的pH值降低，而較低的pH值會抑制乳酸菌的生長代謝，從而減緩利用還原糖的能力。但發(fā)酵30 d時，腸膜明串珠菌發(fā)酵的酸菜中還原糖的殘留量最低，為2.14 g/L；植物乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵的酸菜中還原糖的殘留量接近，分別為4.73 g/L和4.26 g/L。這表明腸膜明串珠菌消耗糖的能力強(qiáng)于其他兩種乳酸菌。

酸菜屬于腌制食品，在腌制初期，蔬菜及發(fā)酵器具上攜帶的腸桿菌和黃桿菌屬等革蘭氏陰性菌會分泌硝酸還原酶，從而將蔬菜中的大量硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[18]。如圖2所示，在整個發(fā)酵過程中，三種乳酸菌發(fā)酵的酸菜中亞硝酸鹽含量的變化趨勢與還原糖的變化相一致。在發(fā)酵0～10 d，三種乳酸菌發(fā)酵的酸菜中亞硝酸鹽含量均迅速下降；在發(fā)酵10 d后，三種乳酸菌發(fā)酵的酸菜中亞硝酸鹽含量則趨于穩(wěn)定，且三種乳酸菌發(fā)酵的酸菜中亞硝酸含量無顯著差異（P＞0.05），其在發(fā)酵30 d時亞硝酸含量范圍在0.95～0.97 mg/L之間，低于國標(biāo)規(guī)定泡菜中的亞硝酸鹽含量為20 mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)[19]。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵酸菜的過程中還原糖和亞硝酸鹽的變化Fig.2 Changes in reducing sugar and nitrite in the fermentation of suan-cai by different lactic acid bacteria

2.3 泡菜中有機(jī)酸的分析

有機(jī)酸時酸菜中重要的呈酸滋味物質(zhì)。在以前的研究中發(fā)現(xiàn)，乳酸在酸菜酸感形成過程中起主導(dǎo)作用，檸檬酸、乙酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸及酒石酸則起到輔助作用，且這些有機(jī)酸含量及比例合適時對酸菜柔和酸感起到促進(jìn)作用，而含量及比例不合適時會破壞柔和酸感[20]。

表1 酸菜中有機(jī)酸物質(zhì)的種類及含量Table 1 Types and contents of organic acids in suan-cai

由表1可知，三種乳酸菌發(fā)酵的酸菜中草酸、蘋果酸、琥珀酸和酒石酸含量無顯著差異（P＞0.05），其含量范圍分別在641.81～691.35 mg/L、695.17～768.66 mg/L、202.43～221.75 mg/L、和78.69～83.67 mg/L。腸膜明串珠菌發(fā)酵的酸菜中乳酸和檸檬酸含量最高，分別可達(dá)7 589.68 mg/L和1 836.48 mg/L，顯著高于其他兩種乳酸菌發(fā)酵的酸菜（P＜0.05），而植物乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵的酸菜中乳酸和檸檬酸含量無顯著差異（P＞0.05）。此外，腸膜明串珠菌發(fā)酵的酸菜中乙酸含量最低，為307.38 mg/L，顯著低于其他兩種乳酸菌發(fā)酵的酸菜（P＜0.05）；而干酪乳桿菌發(fā)酵的酸菜中乙酸含量最高，為486.62 mg/L，分別比植物乳桿菌和腸膜明串珠菌發(fā)酵的酸菜提高了24.84%和58.31%。整個有機(jī)酸組成以乳酸和檸檬酸為主，其含量分別占整個有機(jī)酸比例的65%和15%左右，與馬藝熒等[21]報道的自然發(fā)酵酸菜中有機(jī)酸比例相一致。這表明接種乳酸菌不會影響有機(jī)酸比例的變化。

2.4 泡菜中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

采用GC-MS技術(shù)檢測不同乳酸菌發(fā)酵酸菜中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，共檢測出65種。其中主要揮發(fā)性物質(zhì)種類和數(shù)目如圖3所示，酸菜中揮發(fā)性成分主要包括7種醇類（異戊醇、乙醇等）、13種醛類（苯甲醛、乙醛等）、12種酸類（乙酸、肉豆蔻酸等）、12種酯類（丁酸丁酯、丁酸乙酯等）、4種酮類（3-戊酮、3-羥基-2-丁酮等）、5種異硫氰酸酯類（異硫氰酸丁酯、異硫氰酸烯丙酯等）和13種其他類（1,4-庚二稀、二甲基二硫醚等）。不同乳酸菌發(fā)酵酸菜中醇類、酯類、酮類及異硫氰酸酯物質(zhì)數(shù)目差別不大，腸膜明串珠菌和干酪乳桿菌發(fā)酵酸菜中分別具有最多的醛類和酸類物質(zhì)。鄭文迪等[22]測定廣西發(fā)酵酸菜共有97種揮發(fā)性成分，其中醇類和酯類較多。此結(jié)果與本研究所測略有不同，可能是受兩者地理環(huán)境、釀造環(huán)境等環(huán)境因素，以及原料來源和制作工藝的影響。

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵酸菜中主要揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量Fig.3 Number of main volatile substances in the fermentation process of suan-cai by different lactic acid bacteria

2.5 酸菜揮發(fā)性成分的主成分分析

對不同乳酸菌發(fā)酵酸菜樣品進(jìn)行揮發(fā)性成分的PCA分析，結(jié)果見圖4。由圖4a可知，同一發(fā)酵劑發(fā)酵酸菜聚類明顯，不同發(fā)酵劑發(fā)酵酸菜樣品之間差異顯著。由圖4b可知，通過載荷圖中不同化合物與原點之間距離的正負(fù)確定其與各個主成分之間的相關(guān)性，因其含量的數(shù)據(jù)，可進(jìn)一步判斷出不同乳酸菌發(fā)酵酸菜揮發(fā)性含量的差異程度[23]。故根據(jù)主成分分析，可以較好區(qū)分不同乳酸菌發(fā)酵酸菜的風(fēng)味含量差異。

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵酸菜揮發(fā)性化合物主成分分析得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.4 Principal component analysis score plot (a) and loading diagram(b) of volatile substances in suan-cai by different lactic acid bacteria

2.6 醇類和酸類

醇類物質(zhì)具有令人愉悅的香氣，但其氣味閾值較大，對發(fā)酵蔬菜特征性氣味的影響不明顯。酸菜中含量最高的醇類物質(zhì)為乙醇，其植物乳桿菌發(fā)酵酸菜中乙醇含量顯著高于其他兩種乳酸菌發(fā)酵酸菜（P＜0.05）。而腸膜明串珠菌發(fā)酵酸菜中異戊醇含量顯著高于其他兩種乳酸菌發(fā)酵酸菜（P＜0.05）。異戊醇具有雜氣息和辣味，并帶有醚香和焦香。酸類物質(zhì)的種類最多，其總含量范圍在4.89%～6.00%，含量最高的為肉豆蔻酸。此外，三種乳酸菌發(fā)酵酸菜中乙酸的含量與液相檢測結(jié)果相一致。

2.7 醛類和酯類

大部分的醛類物質(zhì)的氣味閾值均較低，對酸菜風(fēng)味的形成具有較為重要的影響，且可賦予酸菜清香、果香和堅果香[3]。酸菜中含量前三的醛類物質(zhì)為苯甲醛、2,4-二甲基苯甲醛和乙醛。苯甲醛具有特殊的杏仁氣味，而乙醛具有強(qiáng)烈的刺激性氣味。酯類物質(zhì)是發(fā)酵蔬菜呈現(xiàn)香味的主要特征性風(fēng)味物質(zhì)之一。三種乳酸菌發(fā)酵酸菜中共檢測出12種酯類物質(zhì)，其中含量較高的酯類物質(zhì)有：γ-十二內(nèi)酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯和乙酸丁丁酯，其中丙酸乙酯具有強(qiáng)烈的菠蘿香氣。乙酸丁酯等酯類對酸菜醇香具有一定的貢獻(xiàn)。

2.8 酮類和異硫氰酸酯類

在不同乳酸菌發(fā)酵酸菜中共檢測到4種酮類物質(zhì)，分別為2-庚酮、3-羥基-2-丁酮、2-壬酮和3-戊酮。這些化合物是由脂肪酸β-氧化產(chǎn)生的，可為酸菜提供草藥香、水果香和花香[24]。酸菜中含量最高的酮類物質(zhì)為3-羥基-2-丁酮，其含量范圍為0.34%～0.57%，其中腸膜明串珠菌發(fā)酵的酸菜中3-羥基-2-丁酮含量要顯著高于其他兩種乳酸菌發(fā)酵酸菜（P＜0.05）。乳酸菌能夠利用檸檬酸鹽和丙酮酸鹽作為底物生產(chǎn)-羥基-2-丁酮[8]。

異硫氰酸酯類被認(rèn)為是十字花科植物及其發(fā)酵成品特有的風(fēng)味物質(zhì)，具有芳香味[22]，可使蔬菜呈鮮美風(fēng)味。在本研究中共檢測到5種異硫氰酸酯類物質(zhì)，分別為異硫氰酸丁酯、4-戊烯基異硫氰酸酯、2-苯基乙基異硫氰酸酯、異硫氰酸丁烯酯和異硫氰酸烯丙酯，其中異硫氰酸丁酯含量最高，含量范圍為0.30%～0.34%，具有強(qiáng)烈的辛辣味，為酸菜的獨特風(fēng)味提供貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

本研究以酸菜為研究對象，探究了不同乳酸菌發(fā)酵劑對酸菜的風(fēng)味物質(zhì)和感官指標(biāo)的影響。不同乳酸菌發(fā)酵酸菜的理化性質(zhì)差異顯著，其中腸膜明串珠菌發(fā)酵酸菜中pH值和還原糖含量最低，總酸含量最高，但亞硝酸鹽含量無顯著差異。此外，腸膜明串珠菌發(fā)酵的酸菜中乳酸和檸檬酸含量最高，分別為7.59 g/L和1.84/L，且乳酸占整個有機(jī)酸比例的65%左右。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定其揮發(fā)性成分，共檢測出65種，其中醛類13種、酯類12種、酸類12種、醇類7種、異硫氰酸酯類5種和酮類4種。PCA 結(jié)果表明，不同乳酸菌發(fā)酵酸菜的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量均差異顯著。本研究結(jié)果可為篩選符合不同發(fā)酵目的的發(fā)酵劑提供技術(shù)參考。