葉 陽，曾德玉，劉紅梅，劉自山，王 洋*

（四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000）

火腿腸具有適口性好、攜帶方便等優(yōu)點，深受消費者青睞。亞硝酸鹽在高溫肉制品中常用于發(fā)色和防腐，但亞硝酸鹽具有強致癌性[1]。因此，人們在尋找亞硝酸的替代物以減少亞硝酸的使用量。目前多采用外源添加物[2-4]、發(fā)酵[5-6]的方式部分替代亞硝酸鹽。眾多的研究表明，發(fā)酵可顯著提高肉制品的品質(zhì)，其富含的蛋白質(zhì)、脂肪等經(jīng)過微生物氧化分解成氨基酸和短肽更易被人體吸收[7]，改善了肉制品的品質(zhì)，但其發(fā)酵工藝受原料及輔料、發(fā)酵劑種類[8-9]、發(fā)酵時間和溫度、添加量[10]等因素的影響較大。郭丹等[11]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌添加量、發(fā)酵溫度和時間能顯著提高肉制品亞硝酸鹽清除率和感官品質(zhì)，促進氨基酸含量增加[12]。發(fā)酵產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶和酸類物質(zhì)，促進亞硝酸鹽的降解[13-14]。LIU D C等[15]研究發(fā)現(xiàn)，接種過紅曲霉（Monascus）的0.25%安卡米能代替香腸中75%的亞硝酸鹽發(fā)色。1010CFU/mL乳酸菌發(fā)酵能全部代替香腸中亞硝酸鹽發(fā)色[16]。低溫肉制品集營養(yǎng)、風味、安全于一體，是肉制品的發(fā)展方向。然而，受生產(chǎn)工藝等因素影響，褪色現(xiàn)象在低溫肉制品中普遍存在，對亞硝酸鹽的使用量和替代物的選擇提出了更高的要求。袁玲等[17]研究發(fā)現(xiàn)，0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌發(fā)酵液可代替低溫火腿腸中2/3亞硝酸鈉，且李燚等[18]研究發(fā)現(xiàn)，紅曲霉發(fā)酵可促進低溫火腿腸發(fā)色，但少有將紅曲霉（Monascus）和乳酸菌（lactic acid bacteria）聯(lián)合發(fā)酵，探究低溫火腿腸的發(fā)酵工藝。本研究以豬肉為原料，利用紅曲米和乳酸菌菌粉為發(fā)酵劑，研制低溫豬肉火腿腸，通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化其發(fā)酵工藝，并對低溫豬肉火腿腸品質(zhì)進行分析，旨在為實現(xiàn)低硝低溫肉制品的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后腿肉、食鹽、紅曲米、乳酸菌發(fā)酵菌粉（包括保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌）、孜然、胡椒粉、辣椒面、白砂糖、味精：購于沃爾瑪超市；膠原蛋白腸衣（直徑3 cm）：廣州德福隆生物科技有限公司；亞硝酸鹽、復合磷酸鹽、異抗壞血酸（均為分析純）、淀粉（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250C生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；YX-18HM手提式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；BCD-258WDP冷藏冷凍箱：青島海爾股份有限公司；WFJ7200可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；PHS-3C酸度計：天津市賽得利斯有限公司；TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)分析儀：英國Stable Micro Systems UK公司；UltraScan VIS臺式色差儀：上海韻鼎國際貿(mào)易有限公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海齊欣科學儀器有限公司；TK-12型絞肉機：浙江應(yīng)曉工貿(mào)有限公司；MJ-BL25C4型斬拌機：廣東美的生活電器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫豬肉火腿腸制作工藝流程及操作要點

原料整理→分割→絞肉→腌制→斬拌乳化→接種紅曲霉、乳酸菌→灌制→蒸煮→烘烤、冷卻→低溫豬肉火腿腸成品

操作要點：

原料豬肉的挑選：原料選取一定的豬肉肥膘與精肉搭配，肥瘦比為2∶8（g∶g），挑選的肉冷卻至3～5 ℃后再進行加工。

絞肉：將原料瘦肉剔除結(jié)締組織以及可見脂肪部分，切成1～2 cm見方的小塊，用絞肉機將其絞成肉餡待用，控制肉溫10 ℃左右，將肥膘切成1～2 cm見方的小塊。

腌制：在絞碎的瘦肉中加入2.5%食鹽、4 mg/kg亞硝酸鹽、0.03%異抗壞血酸、0.1%孜然、0.1%胡椒粉、0.1%辣椒面、0.1%白砂糖、0.1%味精，攪拌5～10 min混合均勻，排凈肉糜表面氣泡，然后用保鮮膜包好置于4 ℃、相對濕度85%～90%條件下腌制2 h。

斬拌乳化：斬拌前先用冰水（肉質(zhì)量20%）將斬拌機降溫至10 ℃左右，然后投放腌制好肉糜斬拌2 min，接著倒入脂肪末，最后加入6%淀粉攪拌均勻，斬拌3.5 min使原料肉與輔料充分結(jié)合，達到最佳的乳化效果。

紅曲霉溶液制備：以鮮肉糜為基準，將研磨后的紅曲米粉中加入無菌水，充分溶解，制成一定濃度的紅曲霉溶液。

乳酸菌菌懸液制備：以鮮肉糜為基準，在無菌條件下，在乳酸菌發(fā)酵菌粉中加入一定比例的無菌水，攪拌均勻，制成一定濃度乳酸菌菌懸液。

接種紅曲霉和乳酸菌：一定量的紅曲霉、乳酸菌均勻加入經(jīng)斬拌乳化后的肉糜中，于相對濕度92%～96%、發(fā)酵溫度30 ℃的條件下發(fā)酵不同時間。

灌制及排氣：將接種好的肉餡放入直徑約3 cm的豬腸衣中，并用排氣針在腸衣上扎孔排氣，灌腸時肉餡的溫度不超過2 ℃。填充時需小心，盡量減少肉餡中的空氣，松緊適度。

蒸煮：在90 ℃的水浴鍋中加熱腸體，用探針式溫度計測定腸心溫度，待蒸煮后腸心溫度達到70 ℃左右時停止加熱，撈出冷卻晾干。

烘烤：60 ℃的烘箱中烘烤30 min，使腸體本身呈現(xiàn)具有彈性而腸體表面不會出現(xiàn)失水塌陷的情況。

冷卻：豬肉腸烘烤后冷卻至室溫，得到低溫豬肉火腿腸成品。

1.3.2 分析檢測

（1）理化指標測定

全質(zhì)構(gòu)分析（texture profile analysis，TPA）：參照文獻[19]測定。色差：參照文獻[20]，每組隨機選取3只火腿腸，切成薄片，用色差儀測定各試驗組及對照組的明亮度（L*值）、紅綠色（a*值）、黃藍色（b*值）及色差值（ΔE），其中ΔE的計算公式如下：ΔE=

pH值：采用GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》中方法進行測定；亞硝酸鹽：按照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中方法進行測定；氨基酸含量：采用GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》中方法進行測定；菌落總數(shù)：GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品中菌落總數(shù)的測定》。

（2）低溫豬肉火腿腸感官評分方法

低溫豬肉火腿腸感官質(zhì)量評分參照GB 20712—2006《火腿腸》，評分標準見表1。感官評定由15名專業(yè)人員組成的感官評定小組參照按照國標GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評定規(guī)范》對火腿腸的色澤、組織形態(tài)、風味、滋味4個方面進行感官評定，滿分100分。

表1 低溫豬肉火腿腸感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of low-temperature pork ham sausage

續(xù)表

1.3.3 發(fā)酵火腿腸單因素試驗設(shè)計

選取100 g/份豬肉，2.5%食鹽、4 mg/kg亞硝酸鹽、0.03%異抗壞血酸、適量的香辛料和調(diào)味料，紅曲霉添加量分別為（0、1.4%、2.8%、4.2%、5.6%）、乳酸菌添加量分別為（0、3%、4%、5%、6%）、發(fā)酵時間（38 h、40 h、44 h、48 h、52 h）條件下進行單因素試驗，考察各影響因素對火腿腸的氨基酸含量、感官評分、亞硝酸鹽含量、pH、硬度及色差的影響。

1.3.4 Box-Behnken試驗設(shè)計

根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果，選擇紅曲霉添加量（A）、乳酸菌添加量（B）、發(fā)酵時間（C）為影響因素，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert V8.0.6軟件設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests design

1.3.5 產(chǎn)品保藏試驗

以響應(yīng)面優(yōu)化后的配方制成的低溫豬肉火腿腸成品為試驗組，僅加入0.03%的亞硝酸鹽制成的低溫豬肉火腿腸為對照組，設(shè)置3個平行試驗，兩組產(chǎn)品置于37 ℃條件下保藏21 d（相當于4 ℃條件下保藏194 d，即6個月的保質(zhì)期），每7 d測定兩組樣品的菌落總數(shù)，觀察產(chǎn)品的色澤。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert V8.0.6響應(yīng)面設(shè)計軟件、Excel 2016和IBM SPSS Statistics 25.0進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 紅曲霉添加量對火腿腸品質(zhì)的影響

由表3可知，隨著紅曲霉添加量在0～5.6%范圍內(nèi)的增加，火腿腸的氨基酸含量顯著增加（P＜0.05），亞硝酸鹽含量、pH和硬度逐漸降低，感官評分先增加后降低，色差值先降低后增加?？赡苁且驗榧t曲霉添加量增加，紅曲霉初級代謝產(chǎn)物蛋白酶增多，這些蛋白酶能將大分子蛋白質(zhì)分解為多肽、氨基酸等，所以氨基酸含量增加[21]。pH值先大幅下降后緩慢下降再趨于穩(wěn)定是因為紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的堿性蛋白酶平衡了pH的迅速降低[22]，有助于火腿腸品質(zhì)的穩(wěn)定；紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素、乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸類物質(zhì)，兩者對亞硝酸鹽起到降解作用[23-24]，因而亞硝酸鹽含量降低。紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的代謝酶系，使火腿腸的蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生水解，產(chǎn)生大量水溶性物質(zhì)，酪蛋白原有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，肉糜發(fā)酵體系變得軟柔而均勻的組織結(jié)構(gòu)改善了質(zhì)構(gòu)特性，即破壞了肉中蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，引起了硬度的變化[25]，另外紅曲霉具有較強的抗氧化能力，可有效地抑制肉制品中脂肪和蛋白質(zhì)的氧化腐敗，能在一定程度上改善肉制品的劣變[26]。紅曲霉添加量為4.2%時，此時亞硝酸鹽含量為18.5 mg/kg，與空白組相比，亞硝酸鹽減少了8.8 mg/kg，產(chǎn)品色差值（ΔE）最?。?1.6），感官評分最優(yōu)78.2分。因此，最適紅曲霉添加量為4.2%。

表3 紅曲霉添加量對低溫豬肉火腿腸品質(zhì)的影響Table 3 Effect of Monascus addition on the quality of low-temperature pork ham sausage

2.1.2 乳酸菌添加量對火腿腸品質(zhì)的影響

由表4可知，隨著乳酸菌添加量在0～6%范圍內(nèi)的增加，氨基酸含量先增加后穩(wěn)定，色差值先降低后增加，而亞硝酸鹽、pH值顯著降低（P＜0.05），硬度顯著增加，根據(jù)多重比較分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的乳酸菌添加量的各個組之間對于硬度的差異顯著。且在一定范圍內(nèi)增加添加量可以增加產(chǎn)酸，但酸度過低會掩蓋發(fā)酵火腿腸的固有風味，帶來不良的感官品質(zhì)。硬度隨添加量的增加逐漸增加，與紅曲霉添加量對火腿腸硬度的影響不同，因為乳酸菌菌數(shù)增加，發(fā)酵產(chǎn)酸量增加，導致pH的迅速下降，酸誘導蛋白質(zhì)變性和凝膠反應(yīng)，從而增加其硬度[27]。乳酸菌添加量為5%時，亞硝酸鹽含量減少26.1 mg/kg，因為乳酸菌產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶和酸性物質(zhì)，可降低亞硝酸鹽含量[28]，此時火腿腸色差值（ΔE）最?。?.5），感官評分最高78.7分。因此，最適乳酸菌添加量5%。

表4 乳酸菌添加量對火腿腸品質(zhì)的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria addition on the quality of low-temperature pork ham sausage

2.1.3 發(fā)酵時間對火腿腸品質(zhì)的影響

發(fā)酵時間是評價發(fā)酵程度的重要指標。由表5可知，隨著發(fā)酵時間在38～52 h的延長，氨基酸含量、硬度和感官評分先增加后降低，亞硝酸鹽顯著下降（P＜0.05），而pH先緩慢下降后穩(wěn)定。發(fā)酵時間為38～44 h時，發(fā)酵肉中的蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)進一步降解，表現(xiàn)為氨基酸含量增加，發(fā)酵時間＞44 h之后，肉中某些氨基酸轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性風味物質(zhì)[29-30]，使氨基酸含量降低。由前面研究可知，單一菌種發(fā)酵，乳酸菌添加量為5%時，火腿腸亞硝酸鹽含量為27.3 mg/kg，紅曲霉添加量為4.2%時，亞硝酸鹽含量為28.9 mg/kg，4.2%紅曲霉和5%乳酸菌混合發(fā)酵38 h火腿腸亞硝酸鹽含量為13.9 mg/kg，聯(lián)合發(fā)酵比紅曲霉、乳酸菌單菌種發(fā)酵其亞硝酸鹽分別降低了15 mg/kg、13.4 mg/kg，表明紅曲霉和乳酸菌混合發(fā)酵能顯著降低亞硝酸鹽含量，可能是因為在乳酸菌大量存在的情況下，紅曲霉的生長會受到部分抑制[31]，使乳酸菌更好地發(fā)揮作用，同時紅曲霉發(fā)酵促進亞硝酸鹽的降解，從而加快亞硝酸鹽含量的下降。發(fā)酵時間對火腿腸的硬度影響顯著，可能是蛋白質(zhì)變性、凝膠反應(yīng)體系和水分的變化，導致硬度增加[27]。發(fā)酵時間為44 h時，火腿腸的色差值（ΔE）最?。?5.7），感官評分較高為80分。因此，最適發(fā)酵時間為44 h。

表5 發(fā)酵時間對低溫豬肉火腿腸品質(zhì)的影響Table 5 Effect of fermentation time on the quality of low-temperature pork ham sausage

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與回歸模型顯著性分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇紅曲霉添加量（A）、乳酸菌添加量（B）、發(fā)酵時間（C）為影響因素，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert V8.0.6軟件設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，試驗方案和結(jié)果見表6，通過Design-Expert 8.0.6軟件對表6的數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表7。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests

續(xù)表

以感官評分為響應(yīng)值（Y）建立數(shù)學模型，得到回歸方程如下：

Y=76.52+2.44A+3.45B+0.062C-4.83AB-2.20AC-1.68BC-3.14A2+1.84B2-3.68C2

表7 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Table 7 Significance test of regression model coefficient

由表7可知，模型P=0.001 2＜0.05，失擬項P=0.458 9＞0.05，說明該模型自變量與因變量之間函數(shù)關(guān)系顯著，幾乎不存在失擬現(xiàn)象。決定系數(shù)R2=0.880 4，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.726 7，說明模型擬合度高，用于模擬試驗結(jié)果可靠。A、B、AB、A2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），AC對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），BC、B2、C表現(xiàn)為不顯著（P＞0.05），各因素對感官評分順序為乳酸菌添加量＞紅曲霉添加量＞發(fā)酵時間。

2.2.2 響應(yīng)面分析及最優(yōu)工藝驗證

由圖1可知，乳酸菌添加量一定時，紅曲霉添加量和發(fā)酵時間逐漸增加時，感官評分呈先升高后降低趨勢，說明交互作用明顯。通過以上模型得到的火腿腸最佳發(fā)酵工藝為紅曲霉添加量3.66%、乳酸菌添加量為5.00%，發(fā)酵43.86 h，感官評分預測值為81.81分。為了便于實際操作，將上述優(yōu)化的發(fā)酵條件修正為紅曲霉添加量4.0%、乳酸菌添加量為5.0%，發(fā)酵44 h。在此條件下進行3次重復試驗，得到火腿腸的感官評分實際值為82.5分，與預測值相差不大，說明最優(yōu)發(fā)酵工藝條件可靠。

由表8可知，37 ℃條件下保藏7 d，試驗組與對照組菌落總數(shù)差別不大；37 ℃條件下保藏14 d、21 d時，試驗組菌落總數(shù)略高于對照組，但差別不大，說明紅曲霉和乳酸菌確實能夠抑制微生物的生長，達到延長保質(zhì)期的目的。兩組產(chǎn)品21 d后菌落總數(shù)低于國標GB 2726—2016《熟肉制品》中菌落總數(shù)要求（＜20 000 CFU/g），符合衛(wèi)生要求。

試驗組與對照組的感官評分分別為82.5分、81.9分，實驗組方差分析表明，試驗組的紅曲霉和乳酸菌的防腐作用與對照組亞硝酸鹽的作用基本一致，即3.66%的紅曲霉添加量和5.00%的乳酸菌添加量的聯(lián)合作用能夠代替84.31%的亞硝酸鹽對火腿腸進行防腐保鮮，其火腿腸色澤明亮，呈淺紅色。

圖1 各因素交互作用對火腿腸感官評分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the sensory score of low-temperature pork ham sausage

表8 低溫豬肉火腿腸菌落總數(shù)在保藏期內(nèi)的變化Table 8 Changes of total bacteria count of low-temperature pork ham sausage in the preservation period

3 結(jié)論

低溫豬肉火腿腸經(jīng)紅曲霉和乳酸菌發(fā)酵后營養(yǎng)價值顯著提高，火腿腸色澤明亮，呈淺紅色。最佳發(fā)酵工藝條件為紅曲霉4.0%、乳酸菌5.0%，發(fā)酵44 h。在此優(yōu)化條件下，腸體呈淺紅色，口感柔和，感官評分為82.5分，pH值6.24，亞硝酸鹽含量為4.9 mg/kg。保藏試驗表明，紅曲霉4.0%和乳酸菌5.0%可以替代84.31%的亞硝酸鹽對低溫豬肉火腿腸進行發(fā)色。